大鼠STAT3基因靶向shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的针对大鼠信号转导子及转录激活子3（STAT3）基因序列,构建特异性短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。方法根据STAT3基因序列及shRNA设计原则,设计4条干扰效果最佳的shRNA,化学合成4对引物,通过PCR扩增获得dsDNA模板,采用DNA重组技术与pGCsi-U6/Hygro/GFP空载体连接,转化DH5a感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子,抽提重组质粒,进行DNA测序鉴定。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,测序结果与所设计的STAT3 shRNA转录模板序列一致。结论所设计的shRNA编码序列被正确地插入到质粒骨架中,成功构建了STAT3基因的shRNA表达载体。     

编码大鼠血管紧张素转换酶短发夹环RNA质粒的构建与鉴定

目的构建编码大鼠ACE mRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。方法根据大鼠ACE mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠ACE的shRNA表达载体质粒。结论构建的编码大鼠ACE mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳动物细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成si R-NA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用。为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。     

靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选

目的构建靶向木糖转移酶-1（XT-1）的短发卡状小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。     

靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法设计两个小分子干扰RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体,进行酶切鉴定和测序,再转染人大肠癌LoVo细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码EGFR—shRNA的质粒表达载体,并可以进行稳定筛选。     

大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究

目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。     

pGPU6/GFP质粒介导的表达钙网织蛋白基因的短发夹RNA的构建和鉴定

目的构建靶向钙网织蛋白(CRT)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒并鉴定。方法设计并合成4对针对CRT基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒pGPU6/GFP连接,构建4个重质粒,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过Western印迹法检测细胞中CRT基因及蛋白的表达水平。结果经酶切鉴定筛出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CRT构建成功;转染MDA-MB-231细胞后,CRT基因在mRNA及蛋白水平的表达均降低,其中pGPU6/GFP/CRT1的抑制效果最好。结论成功构建了靶向CRT基因的shRNA表达质粒,并筛选出1种对CRT基因有显著抑制作用的shRNA。     

大鼠叉头蛋白转录因子O1基因的shRNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

目的 构建针对大鼠又头蛋白转录因子哦O1（FoxO1）基因的shRNA慢病毒载体,并在大鼠系膜细胞（RMCs）上鉴定其沉默效率。方法利用四质粒合成法合成慢病毒载体。分别用阴性对照慢病毒载体（LV-shNC-GFP组）、shRNA慢病毒载体（LV-shRNA-FoxO1组）和感染增强剂（NC组）处理RMCs。72h后,采用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP）阳性表达率。采用荧光定量PCR检测Fox01mRNA表达情况。15d后,采用蛋白免疫印迹法检测Fox01蛋白的表达情况。结果Lv_shNc_GFP、LV-shRNA-Fox01组GFP阳性表达率分别为87．4％、95．8％;Lv-shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量较NC、LV-shNC-GFP组均降低（P〈0.05）。其mRNA及蛋白抑制率分别达到86．2％和77．3％,而Lv_shNC-GFP、Lv_shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功构建大鼠FoxO1基因的shRNA慢病毒载体能高效、稳定地抑制FoxO1的表达,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定研究基础。     

G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的 构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径.方法 根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链.寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-0250a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定.结果 pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.结论 成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索.肾癌基因治疗奠定了基础.     

AT1R shRNA重组腺病毒载体对SHR主动脉AT1R蛋白分布的影响

目的 利用靶向大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因mRNA的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究对在体自发性高血压大鼠(SHR)主动脉AT1R蛋白分布的影响.方法 重组腺病毒载体通过尾静脉注射法转染SHR,免疫组织化学法测定SHR主动脉AT1R表达.结果 AT1R的shRNA的重组腺病毒载体转染SHR,通过免疫组织化学法证实,大鼠主动脉的AT1R表达明显降低.结论 利用靶向大鼠AT1R 基因mRNA腺病毒载体,在体内环境下可以高效特异性抑制主动脉AT1R表达.     

鼠白细胞介素3真核表达质粒的构建及鉴定

利用鼠白细胞介素3（IL－3）基因构建真核表达质粒,筛选获得的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,证明小鼠IL－3基因正确克隆到pCDNA3真核表达载体上;将获得的真核表达质粒pCDNA3IL－3转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL－3质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,用于小鼠抗生育DNA疫苗在免疫小鼠模型的免疫增强佐剂。     

COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

目的: 构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA (shRNA)的表达质粒.方法:从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列, 根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列, 相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中, 即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. 为得到高效沉默COL1A1-siRNA, 以脂质体LipofectAMINE2000, 将1、2、3、4 μg DNA质粒转染至HSC-T6细胞中, 并观察转染效果. 将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞, RT-PCR分析各组的COL1A1 mRNA表达水平.结果: 靶向COL1A1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切凝胶电泳证实载体构建成功. 1、2、3、4 μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%, 以2 μg siRNA为最佳剂量, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%, 63.3%和80.3%. 结论:筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.     

小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达

目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.     

嵌合DNA hsp70/CD80真核表达质粒的构建及鉴定

目的　构建hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,并对其进行鉴定。方法　采用基因工程技术 ,分别以pBR32 2-hsp70和 pcDNA3-CD80质粒为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出hsp70 /CD80嵌合目的基因 ,然后与 pcDNA3载体进行连接重组 ,构建成hsp70 /CD80嵌合DNA真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定。结果　hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒经证实构建成功。 结论　hsp70 /CD80嵌合DNA重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步制备结核病hsp70 /CD80嵌合DNA疫苗奠定了基础。     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S,作为一种高效能HB DNA疫苗的备选对象.方法以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV-S2S基因片段,克隆至相应载体.再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段,并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAX1,然后扩增目的基因测序,确认无误后,转染SP2/0细胞,并分别检测目的基因mRNA,了解其短暂表达与稳定表达情况.结果所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符,目的片断IFNα-8-S2S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符.HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变.2处有义突变是703-705位CCG突变为CAG,799～801位ATA突变为ATG.表达质粒转染SP2/0细胞后,均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA.结论经分析表明,HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质.可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S的构建,并成功检测到目的基因的表达,为制造高效能HB DNA疫苗提供了新的备选对象.     

pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的人硫酸酯酶修饰因子2（SUMF2）真核表达载体。方法用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,HBEC）获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符。酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的片段。经测序鉴定,序列与GenBank（NM₀15411.2）中的序列高度同源。荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达。Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础。     

BTBD10基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

目的构建BTBD10重组真核表达载体,观察BTBD10在HEK293细胞中的定位。方法利用PCR方法扩增BTBD10全长,经HindIII和BamHI酶切后连接入pGFP-C3真核表达载体,构建pGFP—C3-BTBD10重组表达质粒,转染HEK293细胞,利用激光共聚焦显微镜观察BTBD10在细胞中的定位。结果经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框。激光共聚焦显微镜观察到空质粒pGFP—C3转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pGFP-C3-BTBD10重组载体后,可见绿色荧光分布于HEK293细胞膜一侧的细胞浆中,提示BTBD10定位于细胞浆中。结论成功构建人BTBD10真核表达载体,BTBD10定位于哺乳细胞的细胞浆中,可能发挥蛋白之间的相互作用。     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因真核表达质粒的构建

作者用螯合树脂(Chelex-100)提取阴道毛滴虫基因组DNA,PCR扩增出阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因,克隆入pMD-18T载体,亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒。经PCR及酶切鉴定,Fd基因体外扩增产物为306bp,与已知序列吻合。成功构建了Fd基因的真核表达质粒。     

鼠疫菌6Mdal质粒二聚体的发现及初步鉴定

云南省一株鼠疫菌,所含的6Mdal质粒可形成二聚体,其功能不变。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。