微波炉加热质粒DNA快速提取法

介绍一种以微波炉加热快速提取质粒的方法，所提取的ＤＮＡ纯度，重复性均好，操作简便，整个提取过程不超过２０ｍｉｎ，省时省力，适用于规模筛选重组克隆子，也可直接用于转化、酶切及ＤＮＡ序列测定。     

一种改良的质粒DNA的快速提取方法

目的：建立一种确实有效的更实用的小量质粒ＤＮＡ的提取方法。方法：将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒ＤＮＡ，然后采用紫外分光光度计测定含量，并且进行酶切。结果：每毫升原细菌培养物质粒ＤＮＡ的产量明显增高，且酶切效果极好。结论：改良后的质粒ＤＮＡ提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点，适合于应用与推广。     

一种适合序列分析的快速重组质粒DNA制备法

应用阳离子去垢剂十六烷基三甲基溴化铵沉淀重组质粒ＤＮＡ，得到的ＤＮＡ制剂纯度高，可直接用于双股ＤＮＡ序列分析，本法省时，ＤＮＡ序列分析重复性好。     

一种制备质粒DNA的改良碱裂解法

目的介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。方法使用替代试剂，建立改良的碱裂解法进行质粒DNA提取，并用琼脂糖电泳验证所得的质粒的质量，紫外测量估算产量及纯度。限制性酶切验证其用度。结果琼脂糖电泳显示质粒DNA条带明亮，以超螺旋方式为主。A260／280为1．903，含量为320μg／mL，酶切后得到约500bp的目的片段。结论改良碱裂解法操作简单、实用，所得样品纯度高，达到了分子生物学常规实验的要求。     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止Ｒｎａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

大批量质粒DNA的快速提取

大批量质粒ＤＮＡ的快速提取张风云，汪洛，孙士勇，张乃蘅（北京医科大学生物化学与分子生物学系１０００８３）质粒ＤＮＡ的快速提取是分子生物学基本技术之一，目前常用的方法主要有煮沸法和碱性裂解法。这两种方法具有简便易行的特点，从１．５ｍｌ未经氯霉素扩增的过...     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置（ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ）提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止ＲＮａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

质粒P^JSB15DNA的提取及鉴定研究

质粒Ｐ＾ＪＳＢ１５ＤＮＡ含有ＩＬ－２ＲαｃＤＮＡ６７３ｂｐ片段，本研究从３０００ｍｌ菌液中提取出７．９２ｍｇｇ质粒Ｐ＾ＪＳＢ１５，收获率为２．６４ｍｇ／Ｌ。同时对其纯度，浓度，分子量及酶切图谱进行了鉴定和分析。     

简便、快速、高效的大肠杆菌转化法

本文建立了一种用Ｍｇ２＋诱导和贮存大肠杆菌受体细胞的转化法。用该法对大肠杆菌Ｃ６００、ＪＭ１０３和ＤＨ５ａ进行ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ转化，转化率≥１０８转化子／μｇＤＮＡ；分别在对在一２０℃下贮存１一４个月的受体细胞转化，也能获得１０℃转化子／μｇＤＮＡ转化率。此法能适用于小于１０ｋｂ的常用质粒ＤＮＡ的转化．同ＣａＣｌ２处理法相比，转化率高、简单、快速、方便。     

质粒DNA的提纯与鉴定

质粒ＤＮＡ的提纯与鉴定生物化学教研室王以薇，徐桦关键词质粒，载体ＤＮＡ，限制性内切酶中图号Ｒ５０３基因重组是当代生物工程技术中广为应用的一种新手段。目前常用的载体之一是细菌质粒。细菌质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，结构为环状ＤＮＡ，大小相当于细...     

细菌质粒DNA纯化方法的研究

以HBV DNA的克隆菌E.coli.JM83为出发菌株,对比研究了三种纯化细菌质粒DNA的方法。实验结果表明,CsCl密度梯度超速离心法的得率和产品纯度均佳,但操作繁琐,花费昂贵;Sepharose 4B柱层析纯化法简便快速又勿需专门仪器,缺点是产品纯度不够高;电泳洗脱法的得率虽不及超速离心法,但产品纯度与之相同,由于操作简便,花费大大降低,因而适合普遍采用。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

人类疱疹病毒6型U94基因克隆?表达?纯化及抗体制备

目的:制备人类疱疹病毒6型U94蛋白及其抗体.方法:PCR扩增U94基因,经测序后克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中.重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导蛋白表达.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.表达的蛋白经亲和层析纯化.纯化的蛋白免疫动物制备抗血清.结果:成功地获得了高纯度的U94融合蛋白,纯度可达90%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:100 000.结论:获得高纯度的U94融合蛋白及其高效价的抗体.     

12-ACS/pcDNA3.1-VEGF121纳米粒的制备及应用

目的 利用基因工程技术构建的pcDNA31-VEGF121真核表达质粒,制备由12-烷基化壳聚糖包裹的纳米粒,并将其在体外对基因DNA的保护作用进行检验. 方法 采用碱裂解法白转化阳性细菌菌液中提取出pcDNA3.1-VEGF121真核表达质粒;采用复凝聚法制备基因-壳聚糖纳米粒12-ACS/pcDNA31-VEGF1...     

人IL—2cDNA的亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建重组人IL－2表达质粒并观察其在大肠杆菌中的表达效率。方法应用重组DNA技术，将人IL一2cDNA亚克隆于pKK223－3表达载体，构建成pKK223－3－IL－2重组表达质粒，转化JM105受体菌后得到工程菌，命名为JM105／PKK223－3－IL－2。结果凝胶电泳和核酸杂交证实，人IL一2cDNA已成功地插入到pKK223－3质位的EcoRI－HindIII位点。在异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导下，工程菌中重组人IL－2表达效率为26％；诱导8h，IL－2的产量达峰值；用含TritonX100的缓冲液反复洗涤，获得纯度很高的包含体。结论人IL-2cDNA在tac启动子控制不能在大肠杆菌中高效地表达人IL-2。     

小鼠MIF在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：获得足够量的高纯度小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)重组蛋白。方法：酶切重组克隆质粒pMD18-MIF，将片段插入原核表达载体pQE31，构建相应的重组表达质粒pQE31-MIF，将此质粒转化大肠杆菌M15，得到转化子。经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析，并用Ni—NTA凝胶进行纯化。结果：MIF基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在M15中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应的特性。得到了纯化的目的蛋白。结论：MIF基因片段可在大肠杆菌中有效表达，表达产物可以与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应，并得到纯化的MIF。     

结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌复活促进因子B(RpfB)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfB基因(1089bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了RpfB蛋白;利用Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现61KDa处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfB基因的重组表达质粒pET32a( )-RpfBv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶的表达、纯化及晶体分析

目的 纯化腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶TTE1925,用于晶体生长和三维结构分析.方法 将tte 1925基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E. coli BL 21(DE 3)后获得表达菌株.该菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导高效表达出带有谷胱甘肽S转移酶标签的可溶性融合蛋白,经过Glutathione Sepharose~(TM)4B亲和层析、Resource Q 6mL离子交换层析和10/300 superdex 200分子筛层析纯化后,得到目的 蛋白TTE1925.结果 纯化后蛋白的纯度达到99%以上.蛋白采用悬滴气相扩散法得到衍射至1.9(A)的棒状晶体.结论 成功制备了高纯度TTE1925蛋白,获得TTE1925蛋白质晶体,为进一步解析变旋酶的三维结构及其生物学功能分子机制研究奠定了基础.     

含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件（PPRE）报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增，为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体。方法取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌，再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养，挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒，紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度，并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落，挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE—luc质粒其A260/A280=1．84，浓度为750ng／μl。结论成功转化并扩增了p4×PPRE—luc质粒，为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒。     

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的：对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法：用RT PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段（约900?bp）,克隆至质粒载体pMD18 T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18 T hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载pET30a(+) hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化。结果：RT PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18 T hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5?kD,其表达量达菌体总蛋白的40％左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5％的重组蛋白,纯化回收率达40％。结论：成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。