小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用

目的克隆编码小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段,构建、包装Klotho重组腺相关病毒表达体系,并检测rAAV/mKL载体表达功能。方法选择RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白的基因片段,将该片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-IRES-hnGFP,采用酶切及DNA测序鉴定;利用AAV-293细胞包装rAAV/mKL,经转染7901细胞,检测其Klotho表达情况。结果本文成功克隆出序列信息和读码框完全正确的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段,并构建pAAV/mKL克隆。在AAV-293细胞中包装出rAAV/mKL,病毒原液转染7901细胞后其Klotho mRNA表达上调,而细胞上清液Klotho蛋白也明显增加(P<0.01)。结论成功构建小鼠Klotho重组腺相关病毒载体(pAAV/mKL),获得了rAAV/mKL,并经转染7901细胞验证其基因表达功能正常,这就为进一步研究Klotho基因治疗衰老相关性疾病提供了技术基础。     

日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的扩增和克隆

目的克隆日本血吸虫14-3-3抗原的编码基因,以研究其用于血吸虫病免疫诊断和免疫预防效果.方法以日本血吸虫成虫RAN为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增14-3-3抗原基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定.结果RT-PCR扩增出一条约780bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增出大小相同带.结论日本血吸虫14-3-3抗原重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步的研究提供了条件.     

细胞毒性T淋巴细胞抗原4免疫球蛋白重组腺相关病毒载体的构建及其在移植肝中的表达

目的 将细胞毒性T淋巴细胞抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)cDNA克隆到腺相关病毒载体pSNAV中,获得目的基因在移植肝表达,为器官移植免疫耐受基因治疗奠定基础。 方法 应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建pSNAV-CTLA-4Ig,转化DH-5α,得到抗性克隆,BamH Ⅰ酶切鉴定。用脂质体将psNAV-CTLA-4Ig导入BHK-21中,G418筛选,以HSV1-rc感染此细胞株,产生pSNAV-CTLA-4Ig病毒。斑点杂交法测定病毒滴度, PCR鉴定CTLA-4Ig基因的整合并测序鉴定CTLA-4Ig全长,免疫组织化学方法检测CTLA-4Ig蛋白在大鼠移植肝中的表达。 结果 重组质粒经BamH Ⅰ酶切得到CTLA-4Ig全长cDNA片段,表明CTLA-4Ig成功地插入pSNAV内;病毒滴度测定的病毒颗粒数为8.5×1011／ml;PCR扩增产物为500~600 bp的基因片段,证实有CTLA~4Ig基因的整合;所测得的DNA序列与已知的CTLA-4Ig基因序列完全一致。经pSNAV-CTLA-4Ig病毒灌注的肝脏可见CTLA-4Ig蛋白的表达。 结论将CTLA-4Ig cDNA成功克隆到腺相关病毒载体pSNAV内,证实CTLA~4Ig cDNA正确插入pSNAV多克隆位点内,CTLA-4Ig蛋白可在移植肝中表达。     

β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化

目的 构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化,为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础.方法 根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段,克隆进原核表达载体pET-28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),测序鉴定后,通过IPTG诱导表达出目的 蛋白,经亲合层析纯化.结果 从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1 506 bp,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pET28a-BACE构建正确,表达融合蛋白分子量约为55 kD,经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的 蛋白.结论 在大肠杆菌中获得了小鼠β分泌酶的高效表达,为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础.     

弓形虫组蛋白H3．3编码基因的亚克隆及序列分析

目的克隆弓形虫组蛋白H3.3(Tg H3.3)的编码基因,以研究其在弓形虫病免疫诊断及免疫预防上的作用。方法以弓形虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增弓形虫组蛋白H3.3基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出一条约411bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增的大小相同条带,序列测定结果表明其具有411bp的开放阅读框。结论成功构建了弓形虫组蛋白H3.3重组pGEM-T克隆载体,并完成了序列测定,为进一步的研究提供了条件。     

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析

目的从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因并进行克隆,为利用其表达的重组蛋白建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实。结果PCR法扩增出了一个大小约597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-TgMIC10作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF),编码198个氨基酸,理论分子量23kDa,与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫Tg-MIC10基因具有高度的同源性(99.5%)。结论本实验成功地克隆了TgMIC10编码基因,为进一步研究提供了条件。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定

目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体,为研究其抗肿瘤功能奠定基础。方法提取基因组RNA,利用特异性引物进行RT-PCR反应,扩增全长TSLC1基因片段,与真核表达载体pReceiver-M29载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增,以获得重组载体,应用酶切、PCR及测序鉴定此重组载体。结果RT-PCR获得约1 329 bp大小的特异性TSLC1基因片段;测序鉴定证实,TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1。     

人Parkin基因重组质粒的构建

目的应用分子生物学技术构建人Parkin基因重组质粒。方法从人类胎儿黑质组织中提取总RNA,以RT—PCR法扩增Parkin的cDNA片段;将此片段克隆于pUCm。T载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果克隆的cDNA与GeneBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的人Parkin的cDNA全序列。结论成功构建了人Parkin基因重组质粒。     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

HEV ORF3真核表达载体的构建

目的 构建戊型肝炎病毒（HEV） ORF3真核表达载体pcHEV3并进行初步鉴定.方法 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中提取HEV RNA,逆转录法合成HEV cDNA,采用RT-PCR方法扩增HEV ORF3 cDNA片段,将其克隆至载体质粒pcDNA3,构建HEV ORF3真核表达载体,经抗生素初步筛选后,重组阳性载体进行酶切和测序鉴定.结果 从实验感染HEV新疆株的猕猴胆汁中克隆出HEV ORF3全长cDNA片段,经酶切鉴定及DNA测序鉴定,成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体pcHEV3.结论 成功构建HEV ORF3蛋白真核表达载体,为进一步研究HEV ORF3蛋白的功能提供了条件.     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

日本血吸虫卵黄铁蛋白基因的体外扩增及逆转录病毒pLXSN-Fer1重组质粒的构建

目的　构建日本血吸虫ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 真核表达重组逆转录病毒,为进一步在细胞中表达及ＤＮＡ免疫作准备。方法　用ＰＣＲ技术从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增编码卵黄铁蛋白（ｙｏｌｋ ｆｅｒｒｉｔｉｎ,Ｆｅｒｌ） 的基因片段,定向克隆入ｐＬＸＳＮ 逆转录病毒载体,然后经氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果　从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增出特异的卵黄铁蛋白的基因片段,克隆成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。结论　构建成功ｐＬＸＳＮ－ Ｆｅｒ１ 重组逆转录病毒。     

粉尘螨cDNA文库的构建

目的构建粉尘螨cDNA表达文库。方法提取粉尘螨总RNA和mRNA,以NotIdT18作为引物反转录合成第一链,置换法合成第二链。加EcoRI接头,经NotI酶切后,应用定向克隆技术将相应dscDNA片段插入λExCell/NotI/EcoRI/CIP载体的NotI和EcoRI双酶切位点间,经包装、转染宿主菌,构建成cDNA文库。检测文库库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入片段大小进行分析。结果已成功构建一个含4.8×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.2kb。结论所建文库容量及插入片段大小适合对粉尘螨特异性重组变应原的进一步研究。