灰树花DNA对小鼠非特异性免疫功能的影响

目的:以自然杀伤(NK)细胞杀伤活性、巨噬细胞吞噬功能及TNF-α,IL-1的产生水平为指标,研究灰树花DNA时小鼠非特异性免疫功能影响.方法:用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性,吞噬中性红实验法检测巨噬细胞吞噬功能,生物活性测定法检测巨噬细胞TNF-α和IL-1的产生水平.结果:灰树花DNA处理组小鼠脾NK细胞杀伤活性,巨噬细胞吞噬功能及TNF-α,IL-1的产生水平均较生理盐水对照组呈现有显著意义的增高或增强.结论:灰树花DNA可增强机体非特异性免疫功能,间接发挥抗肿瘤作用.     

IκBα基因转染抑制脂多糖诱导的小鼠炎症反应

目的:构建携带SAA3启动子的IκBα表达载体,观察其对NF-κB活性及脂多糖(LPS)诱导的小鼠炎症反应的影响,探讨脓毒症的治疗方法。方法:离体细胞实验:离体混合培养小鼠肝细胞和库普弗细胞,分为正常组、LPS处理组和LPS+基因转染组,LPS注射24 h后,测定各组细胞上清AST、ALT、LDH和TNF-α、IL-6水平。小鼠在体实验:(1)小鼠随机分为正常组、LPS处理组和LPS+基因转染组3组(n=10),小鼠腹腔注射250μg LPS或等量生理盐水,24 h后处死,取血清和肝组织测定TNF-α、IL-6水平。(2)小鼠随机分为LPS处理组和LPS+基因转染组(n=21),0、48 h二次注射150μg LPS,首次注射后不同时点(0、2、24、48、50、72、96 h)取肝组织测NF-κB和IκBα活性,以0 h测得值作为正常对照。(3)小鼠随机分为LPS处理组和LPS+基因转染组(n=20),腹腔注射350μg LPS后,继续饲养96 h,观察各时点(0、12、24、36、48、72、96 h)小鼠生存率。结果:与LPS组相比,LPS+基因转染组共培养细胞上清中AST、LDH和TNF-α、IL-6...     

SRC-1蛋白缺失对严重烧伤小鼠肝脏NF-κB表达及核转位的影响

目的 研究类固醇受体辅活化子-1(SRC-1)基因敲除小鼠严重烧伤早期肝脏核因子-κB(NF-κB)表达及核转位的变化.方法 以SRC-1基因敲除小鼠为实验组,以野生型小鼠为对照组,以小鼠15%～20%TBSAⅢ度烧伤为实验模型,观察两组在严重烧伤前及烧伤后1、6、12h肝脏总蛋白NF-κB表达及伤后核转位的变化,同时提取致伤前、致伤后1、6h血清标本,观察炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的变化.结果 与野生型小鼠相比,SRC-1基因敲除小鼠严重烧伤后肝脏总蛋白NF-κB出水平有所增加,而野生型小鼠有所下降.从核转位的情况来看,SRC-1基因敲除小鼠致伤后NF-κB的入核能力明显强于野生型小鼠,6h差别最大.两组致伤后炎性细胞因子TNF-α、IL-1βIL-6均升高,但SRC-1基因敲除小鼠升高更为显著.结论 SRC-1蛋白对严重烧伤具应激性保护作用,缺失SRC-1蛋白使NF-κB功能增强更显著,致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6更大量产生,使整体伤情征象更重. -1β、IL-6的变化.结果 与野生型小鼠相比,SRC-1基因敲除小鼠严重烧伤后肝脏总蛋白NF-κB出水平有所增加,而野生型 鼠有所下降.从核转位的情况来看,SRC-1基因敲除小鼠致伤后NF-κB的入核能力明显强于野生型小鼠,6h差别最大.两组致伤后炎性细胞因子TNF-α、IL-1βIL-6均升高,但SRC-1基因敲除小鼠升高更为显著.结论 SRC-1蛋白对严重烧伤具应激性保护作用,缺失SRC-1蛋白使NF-κB功能增强更显著,致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6更大量产生,使整体伤情征象更重. -1β、IL-6的变化.结果 与野生型小鼠相比,SRC-1基因敲除小鼠严重烧伤后肝脏总蛋白NF-κB     

白介素-18对树突状细胞瘤苗的抗肿瘤作用

目的：进一步提高树突状细胞（DC）瘤苗的抗肿瘤作用。方法：以腺病毒为载体转染目的基因至DC，研究DC瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。分别以乳酸脱氢酶（LDH）释放法、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）活性和细胞因子的分泌水平。结果：IL-18／gp100-DC瘤苗对荷瘤小鼠具有显著的治疗作用。IL-18／gp100-DC瘤苗治疗后，能明显增强CTL和NK活性，提高IFN-r和IL-2的分泌水平，使体内肿瘤细胞发生明显坏死，瘤体及瘤周有大量炎性细胞浸润。CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞为发挥抗肿瘤作用所必须，NK细胞也起到一定的作用。结论：辅助性T细胞1（Th1）型细胞因子IL-18基因修饰的gp100-DC瘤苗能有效地诱导抗肿瘤免疫反应。     

IL-18基因修饰小鼠CT26结肠癌细胞体内外生物学特性

目的 观察腺病毒介导IL-18基因修饰的小鼠CT26结肠癌细胞体内外的生物学特性。方法 采用ELISA法检测细胞因子，MTT法检测细胞的增殖反应能力，^51Cr释放法检测脾细胞的NK活性及CTL杀伤活性。结果 IL-18基因修饰的CT26细胞能够在转染后4小时即可分泌IL-18，48小时达到高峰，96小时后开始下降。IL-18基因转染对CT26在体外培养过程中的增殖与形态没有明显的影响。IL-18基因修饰的CT26细胞与野生型的CT26细胞和LacZ转染的CT26细胞相比，在体内的致瘤性明显降低，平均生存期延长。IL-18基因修饰的CT26细胞在体内的抗肿瘤免疫反应与IL-18活化NK细胞和CTL细胞的杀伤活性有关。结论 IL-18基因修饰的肿瘤细胞能够激发机体的抗肿瘤免疫反应，但不足以完全抑制肿瘤细胞的生长，还需要与其他因素联合才能够有效地清除肿瘤细胞。     

不同方式递送质粒DNA诱导体内表达效果的实验研究

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb／c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶（1uc3蛋白的重组质粒（pGL-3-CMV）或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部（2μg质粒DNA／4．5Mpa／枪）。于质粒注入后24～144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法。     

热射病小鼠早期中枢神经炎症和外周炎症的变化

目的 探讨热射病小鼠早期(0～24 h)中枢神经炎症和外周炎症的变化及其相关性.方法 70只BALB/c雄性小鼠按随机数字表法分为正常对照组和热射病后各时相(0、1、6、12、24 h)观察组.应用环境模拟舱建立热射病小鼠模型.观察记录各组小鼠生存率、直肠温度变化和体质量变化,Real-time PCR检测大脑皮层和海马炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,ELISA测定外周血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌情况,鲎试剂动态浊度法检测血清中内毒素浓度.结果 热暴露后小鼠直肠温度超过42℃,1～2h出现低温期,24 h后小鼠存活率为78.57％,成功制备热射病小鼠模型;大脑皮层及海马在热暴露后1h炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因表达显著增加并达到最高峰值(P＜0.01),6h后逐渐降低但仍明显高于正常对照组(P＜0.01),24 h后基本恢复至正常对照组水平(P＞0.05);外周血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6在1h后含量显著增加(P＜0.01),之后缓慢下降,到24 h后仍高于正常对照组(P＜0.01);血清内毒素在热暴露即刻(0 h)开始明显升高,6h后达到峰值,至24 h仍明显高于正常对照组(P＜0.01).结论 热射病小鼠在热暴露12 h内中枢神经系统出现一过性炎症反应,而外周炎症反应持续至24 h之后,提示热射病小鼠早期中枢神经炎症反应与外周炎症反应可能是相互独立发生.     

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化和作用

目的 探讨H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子的变化和作用. 方法 通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠，于感染后2、4、6、10、14 d取小鼠肺组织匀浆，分别测定肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。结果 试验组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10在不同时间点浓度均显著高于正常对照组(P<0.05)，TNF-α和IL-1β于14d后趋于正常，而IL-6和IL-10增高持续至14d后。结论 H9N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子发挥重大作用，TNF-α和IL-1β起致炎作用，IL-6可能和IL-10一样，发挥抗炎作用。     

肿瘤生物治疗新方法的研究

本文主要简述"九五"攻关期间<肿瘤生物治疗新方法的研究>课题组经协作攻关主要完成的研究工作(1)重组人TNF、IL-2及B7重组腺病毒表达载体的构建及其包装体系的建立;(2)腺病毒介导的人TNF-α基因转染对人肝癌细胞凋亡和MHC-1类分子表达的影响;(3)瘤体内/瘤周注射TNF-α重组腺病毒和(或)IL-2重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用及其免疫机理研究;(4)粘附LAK细胞的制备、体外扩增、冻存及复苏;(5)转染B7、IL-2、TNF-α基因重组腺病毒的肿瘤细胞及A-LAK的生物学特性研究;(6)人肝癌组织中MAGE基因的表达及MAGE基因修饰树突状细胞体外抗肿瘤作用;(7)转基因瘤苗临床应用安全性的初步检测.这些研究工作的完成为肿瘤基因治疗的临床应用打下基础.     

肺炎克雷伯杆菌对小鼠中性粒细胞表达IL-1β和TNF-α的影响

目的观察肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,Kle.p）感染对小鼠中性粒细胞细胞因子表达的影响。方法以热灭活的Kle.p感染小鼠肺部建立急性肺炎模型，分离并纯化中性粒细胞（PMN），用RT-PCR、Western blotting、ELISA等方法检测PMN中TNF-α和IL-1β的表达改变。结果Kle.p感染促进了早期小鼠中性粒细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的mRNA表达及分泌，TNF-α mRNA表达在感染6h最高，12h后降低；IL-1β的mRNA表达在感染12h最强；24h后两者表达均减弱，但仍显著强于对照组。Western blottin结果显示，感染6h后TNF-α、IL-1β的蛋白表达量最高，24h后表达明显减少。ELISA结果显示，TNF-α分泌量在感染后6h最高，24h后明显降低，但仍较对照组高；IL-1β分泌量峰值在感染12h后出现。结论TNF-α可能主要参与小鼠感染热灭活Kle.p早期的PMN免疫防御功能；而IL-1β则主要参与感染中后期的PMN免疫防御功能。     

免疫抑制大鼠模型感染后TNF-α和IL-6的基因表达

目的观察免疫抑制大鼠腹腔感染后组织中TNF-α和IL-6基因表达的变化。方法60只SD大白鼠建立正常对照、免疫抑制两组动物模型,用盲肠结扎加穿刺法(CLP)形成腹腔感染,分别测定术后不同时段肝、肺组织中TNF-αmRNA和IL-6mRNA的相对表达量并加以比较。结果(1)CLP前,免疫抑制大鼠肝、肺组织内TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达均低于对照组(P<0.05)。(2)CLP后,两组大鼠肝、肺组织内TNF-αmRNA,IL-6mRNA的变化基本一致,于CLP后3h升高,而后平稳上升,24h达最大值;免疫抑制大鼠肝、肺组织内TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表达始终低于对照组。(3)IL-6mRNA在CLP后24h平均升高8.97倍,TNF-αmRNA则为3.96倍。结论(1)免疫抑制大鼠腹腔感染后发生MODS可能系机体处于CARS状态的结果,这种状态下细胞因子基因变化的规律类似于因SIRS导致MODS时的变化。(2)机体免疫功能的改变可能发生于细胞因子转录水平,IL-6mRNA可作为严重感染的预警指标。     

黄芪多糖对糖尿病鼠T细胞亚群的免疫调节作用

目的 探讨黄芪多糖（APS）对NOD小鼠T细胞亚群的免疫调节机制。方法 观察APS组和对照组NOD鼠胰岛浸润淋巴细胞免疫组化、脾T淋巴细胞CD4^＋／CD8^＋亚群比值，RT—PCR法检测两组胰岛中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、TNF—α和INF-γ Th1型细胞因子的mRNA表达。结果 APS可以降低NOD小鼠1型糖尿病的发病率，下降胰岛浸润炎症细胞及脾脏中的CD4^＋／CD8^＋亚群比值。与对照组相比，APS组胰岛IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α和INF-1的mRNA表达水平明显下调。结论 APS能纠正NOD小鼠Th1型细胞／细胞因子的免疫失衡状态，预防1型糖尿病的发生。     

麦门冬汤体内抑瘤效应的免疫机制探讨

目的从免疫学角度探讨麦门冬汤抗肿瘤作用的机制。方法用小鼠膀胱癌细胞建立小鼠移植瘤模型，给予不同剂量的麦门冬汤灌胃，检测其抑瘤率，以免疫学方法检测小鼠治疗后的细胞免疫功能的改变（MФ、NK、IL-2、TNF-α、T淋巴细胞转化率），并以流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群（CD4^＋、CD8^＋）。结果麦门冬汤能抑制肿瘤生长，其主要机制是增强小鼠的细胞免疫功能，提高患者免疫监视功能，使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，及时杀伤和清除肿瘤细胞。结论麦门冬汤具有显著的抑瘤作用，其作用机制主要为提高机体的细胞免疫功能，提高患者免疫监视功能，使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，及时杀伤和清除肿瘤细胞。     

白细胞介素-23基因修饰树突细胞获取凋亡癌细胞抗原诱导的抗胰腺癌免疫治疗

目的 探讨白细胞介素23（IL-23）基因转染的树突状细胞（DC）负载凋亡癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌的治疗作用。方法 克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC后检测其表型及自分泌IL-23和IL-12的能力;观察各组脾脏T淋巴细胞γ干扰素（IFN-γ）和IL4的分泌量以及DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对胰腺癌细胞的杀伤作用。转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗对小鼠抗肿瘤的免疫保护作用和肿瘤抑制作用。结果基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强;DC自分泌IL-23和IL-12的能力显著增强。DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,IL-23转染组每24hIFN-γ的分泌（最高为535pg／ml／10^6）与其他各组比较（对照组每24h为60pg／ml／10^6）,P〈0．01;转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTL活性（P〈0．05）。接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强;对肿瘤的生长有明显抑制作用,治疗组荷瘤鼠生存期与其他各组比较差异有显著意义。结论IL-23使DC抗原递呈能力更强,IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTL免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力。     

转基因树突状细胞瘤苗诱导的CTL对肿瘤细胞的靶向性杀伤作用

目的：观察mAFP基因转染的树突状细胞（DC）瘤苗诱导的靶向性细胞毒性T细胞（以下简称靶向性CTL）对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：用构建的mAFP基因转染的DC瘤苗免疫C57BL／6小鼠,取免疫小鼠脾细胞诱导CTL,LDH非放射性细胞毒性试验检测其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。用ELISA法检测CTL诱导过程中TNF—α和IFN-γ分泌变化规律。结果：AFP基因转染的DC瘤苗免疫小鼠后能诱导具有较高抗肿瘤活性的靶向性CTL,这种靶向性CTL对AFP分泌性肿瘤细胞具有更强的杀瘤活性,且在CTL诱导过程中TNF-α和IFN-γ分泌水平明显增高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈O．05）。结论：AFP基因重组腺病毒修饰的DC瘤苗免疫C57BL／6J小鼠,能诱导出针对AFP抗原的靶向性CTL,并也能通过分泌TNF-α和IFN-γ实现对AFP分泌性肿瘤细胞的特异性杀伤。     

转TNF—a基因肿瘤浸润淋巴细胞的构建及其生物学特性的研究

目的用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因转染人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL),构建转基因TIL,对其生物学特性进行研究,为肝癌基因治疗奠定基础.方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因导入人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞,构建一种新型的抗肿瘤效应细胞-转基因TIL.对转基因TIL的增殖能力和细胞表型进行检测,用RT-PCR检测目的基因的表达,TNF-α试剂盒检测TNF-α分泌量,用MTT法检测转基因TIL体外抗肿瘤活性.结果转基因TIL的增殖活性及细胞表型与IL-2活化的TIL相似,转基因TIL 可持续表达TNF-α,其分泌量每24 h达370 pg/5×105 cells.转基因TIL对肝癌细胞株BEL7404 具有较高的杀伤活性.结论转基因TIL维持较高的稳定性,可持续表达TNF-α,具有良好的体外抗肿瘤作用,对肝癌治疗具有良好的应用前景.     

转TNF-α基因肿瘤浸润淋巴细胞的构建及其生物学特性的研究

目的:用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因转染人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL),构建转基因TIL,对其生物学特性进行研究,为肝癌基因治疗奠定基础.方法:用逆转录病毒载体将TNF-α基因导入人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞,构建一种新型的抗肿瘤效应细胞-转基因TIL.对转基因TIL的增殖能力和细胞表型进行检测,用RT-PCR检测目的基因的表达,TNF-α试剂盒检测TNF-α分泌量,用MTT法检测转基因TIL体外抗肿瘤活性.结果:转基因TIL的增殖活性及细胞表型与IL-2活化的TIL相似,转基因TIL 可持续表达TNF-α,其分泌量每24 h达370 pg/5×105 cells.转基因TIL对肝癌细胞株BEL7404 具有较高的杀伤活性.结论:转基因TIL维持较高的稳定性,可持续表达TNF-α,具有良好的体外抗肿瘤作用,对肝癌治疗具有良好的应用前景.     

仙人掌提取物对S180荷瘤小鼠IL-2、TNF-α的影响

目的观察仙人掌提取物对S180荷瘤小鼠IL-2、TNF-α的影响。方法用S180腹水型肉瘤小鼠的腹水肿瘤细胞悬液接种小鼠左腋皮下复制肿瘤模型。造模后随机分为仙人掌提取物组、肝复乐片组、模型空白组、正常对照组。前两组分别给予仙人掌提取液、肝复乐混悬液灌胃;模空组和正常对照组以生理盐水灌胃。每次0.2 ml/10g.d-1,每天1次,连续10天。于第11天取材测定小鼠血清IL-2、TNF-α含量。结果仙人掌提取物组小鼠血清IL-2水平比模空组明显提高(P<0.01);TNF-α水平明显降低(P<0.05)。结论仙人掌提取物能提高IL-2水平,降低TNF-α水平,有抗肿瘤作用。     

JAB1表达下调对LPS诱导炎性因子TNF-α和IL-6的影响

目的 初步探讨JAB1基因表达下调对炎症反应的影响.方法 构建特异性针对小鼠JAB1基因的RNA干扰真核表达载体,转染到RAW264.7细胞中降低其JAB1基因的表达,观察LPS刺激后培养上清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度变化.结果 成功得到小鼠JAB1基因的RNA干扰真核表达载体(pPUR/U6-siJAB1),将其转染RAW264.7细胞后使JAB1的蛋白表达水平显著下降,经LPS刺激后培养上清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度较正常细胞明显降低.结论 小鼠JAB1基因的低表达使RAW264.7细胞在经LPS诱导后的炎性因子产生降低,推测其在炎症反应中对致炎因素的影响更大.