UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E.Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功:重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。     

突变型脑红蛋白原核表达载体的构建与表达鉴定

目的 为了研究脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)发挥神经保护功能的作用机制,拟构建Ngb中关键氨基酸His突变的原核表达载体,并对其进行诱导表达与鉴定.方法 利用引物突变法和PCR技术,扩增出突变型Ngb的cDNA,并克隆到原核表达载体pBV220,经测序鉴定正确转化到大肠杆菌HB101;对突变型Ngb蛋白进行诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定.结果 与结论成功构建了pBV220-Ngb(H64V)和pBV220-Ngb(H96A)原核表达载体,SDS-PAGE和Western印迹检测结果显示突变型Ngb能够正常表达,为进一步揭示脑红蛋白神经保护功能与作用机制奠定了重要基础.     

人自噬相关基因LC3 B原核表达载体的构建及活性检测

目的：构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到pGEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入pGEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（ Mr）约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3 B在自噬中的作用机制奠定了基础。     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础.方法 以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白.结果 利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白.结论 成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础.     

人心肌肌钙蛋白I第2和第4个密码子同义突变对其在大肠埃希菌中表达的影响

目的 对人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因实行定点突变并进行原核表达，观察此突变对cTnI表达量的影响。方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，设计引物将其第2和第4个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导人宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot鉴定，观察突变对cTnI表达的影响。结果 突变后的cTnI基因与对照组相比在大肠埃希菌中得到高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。结论 成功克隆了cTnI基因，所设计的同义突变可促进cTnI在大肠埃希菌中的高效表达。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

一种热稳定人成纤维细胞生长因子突变体原核表达及活性鉴定

目的原核系统可溶性地表达一种热稳定性的人角质细胞生长因子-2（human keratinocyte growth factor-2,hKGF-2）并鉴定其生物活性。方法通过重叠PCR方法进行定点突变,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2突变体的核酸序列并克隆至原核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。分别检测重组KGF-2及其突变体重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。结果 KGF-2及其突变体具有相同的促Hep-2细胞的增殖能力。室温状态下48 h内,rhKGF-2出现明显降解现象而rhKGF-2突变体几乎没有出现降解,表现出强的热稳定性。结论 KGF-2突变体具有天然KGF-2的生物活性,但其热稳定性明显优于天然KGF-2蛋白,为进一步研究KGF-2的结构和功能奠定了一定的基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的 构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。     

人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达

目的　构建人血管生成素 - 1的原核表达载体 ,并进行表达。方法　利用PCR技术扩出人血管生成素 - 1基因片段 ,并克隆到PQE - 31载体中 ,转化E .coliM 15菌株后进行诱导表达。结果　构建了PQE31Ang - 1原核表达载体 ,在M 15中进行了高效表达。结论　通过原核表达得到人血管生成素 - 1蛋白 ,其具有良好的抗原性 ,为进一步的生物活性和应用研究奠定了基础     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。