雷沙吉兰(Rasagiline)对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的防护作用

目的探讨雷沙吉兰(Rasagiline)对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导PC12细胞损伤阿尔茨海默病(AD)模型的保护作用及其机制。方法不同浓度的Aβ25-35(1μmol/L,10μmol/L,20μmol/L)作用于PC12细胞48h,MTT法检测细胞存活率,选用使细胞存活率降低到64%的Aβ浓度20μmol/L。用不同浓度的雷沙吉兰(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预孵育PC12细胞1h,再加入20μmol/L的Aβ共孵育48h,再测MTT活性,并用荧光染料丫啶橙和溴化乙啶染色,在荧光显微镜下计数凋亡细胞检测凋亡细胞百分率。结果Aβ在20μmol/L时使PC12细胞存活率降低至64%,与对照组差异显著,1μmol/L的雷沙吉兰可显著提高细胞存活率至85%。对照组细胞凋亡率为2%,20μmol/L Aβ作用48h后,PC12细胞凋亡率达13%,1μmol/L的雷沙吉兰使20μmol/L Aβ诱导的PC12细胞凋亡率下降到5%。结论雷沙吉兰对Aβ引起的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制Aβ诱导的凋亡有关。     

雷沙吉兰（Rasagiline）对Aβ25-35诱导PC12凋亡的防护作用细胞

目的探讨雷沙吉兰（Rasagiline）对β-淀粉样蛋白（Ap）诱导PCI2细胞损伤阿尔茨海默病（AD）模型的保护作用及其机制。方法不同浓度的Aβ25-35（1μmol／L，10μmol／L，20μmol／L）作用于PCI2细胞48h，MTT法检测细胞存活率．选用使细胞存活率降低到64％的Aβ浓度20μmol／L。用不同浓度的雷沙吉兰（0．1μmol／L，1μmol／L，10μmol／L）预孵育PC12细胞1h，再加入20μmol／l，的Aβ共孵育48h，再测MTT活性，并用荧光染料丫啶橙和溴化乙啶染色，在荧光显微镜下计数凋亡细胞检测凋亡细胞百分率。结果 Aβ在20μmol／L时使PC12细胞存活率降低至64％，与对照组差异显著，1μmol／L的雷沙吉兰可显著提高细胞存活率至85％。对照组细胞凋亡率为2％．20μmol／L，Aβ作用48h后，PC12细胞凋亡率达13％，1μmol／L的雷沙吉兰使20μmol／L。Aβ诱导的PC12细胞凋亡率下降到5％。结论 雷沙吉兰对Aβ引起的PC12细胞损伤具有明显的保护作用．其机制可能与抑制Aβ诱导的凋亡有关。     

五味子乙素对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨五味子乙素对Aβ25-35引起的褐家鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞毒性的作用,并探讨其可能机制。方法 10、25、50、75、100μmol/L五味子乙素作用于PC12细胞,MTT法筛选低毒性的五味子乙素浓度,Aβ25-35诱导PC12细胞毒性损伤建立阿尔茨海默病体外模型,加入低毒性的五味子乙素,倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活性,RT-PCR法检测PC12细胞β淀粉样前体蛋白(amyloidβ-protein precursor,APP)基因mRNA的表达水平。结果 10、25μmol/L五味子乙素单纯处理可促进PC12细胞增殖,以10μmol/L增长作用更明显,差异具有统计学意义(P0.05),50、75、100μmol/L五味子乙素对细胞有抑制作用,抑制率10%;给予Aβ25-35诱导后PC12细胞存活率降低为(46.4±4.9)%,APP基因表达上调(105±9.3)%;给予10μmol/L的五味子乙素处理后的Aβ25-35组,细胞存活率升高至(107±5.5)%,APP基因表达减少(66.9±7.2)%。结论 10、25μmol/L五味子乙素均可以促进PC12细胞增长,但不具有浓度依赖性;10μmol/L五味子乙素可拮抗Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用,机制可能是通过减少APP表达而起作用。     

丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞保护作用及机制研究

目的 探讨丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞可能的保护作用及机制。方法 将PC12细胞分为5组:空白对照组(未加任何处理药物)、Aβ诱导组(20 μmol/L Aβ处理组)和预处理组(分别加入浓度为5 ml/L、10 ml/L、20 ml/L的丹参川芎嗪注射液孵育24 h后加20 μmol/L Aβ),通过CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察PC12细胞核的改变,荧光分光光度计测定LDH、SOD、GSH及caspase-3活性水平,免疫组织化学方法观察细胞色素C(Cyt-C)蛋白释放水平,Western Blot检测Bcl-2的表达水平。结果 丹参川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)预处理对Aβ诱导的PC12细胞损伤有较好的保护作用,其保护作用随着药物浓度的增加而增强。它能增加Aβ损伤的PC12细胞增殖活力,减少Aβ诱导的PC12细胞凋亡,降低细胞核凝聚现象,抑制Aβ损伤的PC12细胞LDH释放,增强SOD和GSH活性,促进Cyt-C在细胞内表达,降低caspase-3活性,促进Bcl-2的表达。结论 丹参川芎嗪注射液对Aβ诱导的PC12细胞损伤具有与线粒体通路相关的保护作用,其保护作用与它抑制细胞凋亡、抗氧化应激、维持线粒体正常功能、抑制caspase-3的激活、促进抗凋亡因子Bcl-2的表达有关。     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

尼古丁对Aβ25～35细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白代谢的关系

目的研究尼古丁对β-淀粉样蛋白（Aβ）细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白（APP）代谢之间的关系。方法不同浓度的尼古丁分别单独或与Aβ25～35同时作用于PC12细胞24h,然后采用MTT法检测细胞活力;WesternBlot法检测PC12细胞上清液中的可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段（sAPPα）和细胞内胰岛素降解酶的表达水平。结果（1）尼古丁浓度于0.10～500μmol/L时,对PC12细胞无明显毒性作用（均P〉0.05）,当浓度升至1000μmol/L时则产生一定的毒性作用（P≤0.05）;Aβ25～35浓度于1～100μmol/L时对PC12细胞具有明显毒性作用（均P≤0.01）,Aβ25～35浓度降至0.10μmol/L时则失去其毒性作用（P〉0.05）。（2）尼古丁浓度于0.10～1000μmol/L时,对Aβ25～35诱导的细胞毒性呈现不同的作用：尼古丁浓度于0.10～100μmol/L时可部分拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〈0.01）,但不能使PC12细胞活力恢复至正常细胞水平（均P〈0.01）;而当尼古丁浓度于500μmol/L和1000μmol/L时则不产生拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〉0.05）。（3）Aβ25～35（20μmol/L）和尼古丁（100μmol/L,1000μmol/L）单独或联合作用均可引起PC12细胞可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段分泌水平升高（均P〈0.01）,其中以尼古丁浓度为100μmol/L时可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平最高。（4）浓度为20μmol/L的Aβ25～35可导致胰岛素降解酶表达水平降低（P〈0.01）,而浓度为100μmol/L的尼古丁可明显拮抗这种作用（P〈0.01）,1000μmol/L的尼古丁则无明显拮抗作用（P〉0.05）;将浓度为100μmol/L和1000μmol/L的尼古丁分别单独作用于PC12细胞时,胰岛素降解酶表达水平明显升高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）。结论尼古丁对Aβ25～35诱导的细胞毒性的拮抗作用与可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平并无直接关系,而可能与胰岛素降解酶的表达水平相关。     

落新妇苷通过激活PI3K/AKT信号通路和抑制P38MAPK信号通路减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤

目的 研究落新妇苷对H2O2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞影响。方法 将PC12细胞分为5组:对照组、H_2O_2组及不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)落新妇苷组。采用CCK8实验检测各组细胞的活力; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡实验检测各组细胞凋亡率; Western blot检测PI3K、AKT、Caspase3和P38蛋白及其磷酸化激活蛋白的表达水平。结果 与H_2O_2组相比,落新妇苷组细胞的活力显著提高,细胞凋亡率明显降低,活化的凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3表达水平降低,PI3K/AKT途径相关蛋白p-PI3K和p-AKT的表达水平升高,P38 MAPK途径重要蛋白p-P38的表达水平降低。结论 落新妇苷对H_2O_2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞有明显保护作用;这种保护作用可能是通过激活PI3K/AKT信号通路及抑制P38MAPK信号通路实现的。     

PGN对Aβ1-42寡聚体促进BV2细胞分泌IL-1β的影响

目的探讨前炎介质肽聚糖(peptidoglycan,PGN)激活BV2细胞内吞β淀粉样蛋白(amyloid pro-teinβ,Aβ)1-42寡聚体后,对白细胞介素-1β(IL-1β)分泌的影响及其机制。方法采用细胞株传代法培养BV2细胞替代小胶质细胞,按Klein方法制备Aβ1-42寡聚体。将BV2细胞分为PGN(20μg/mL)组、Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组、PGN(20μg/mL)+Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组,比较BV2细胞分泌IL-1β水平;将BV2细胞予PGN(20μg/mL)及PGN+SB202190,比较两组IL-1β分泌水平;将不同浓度的PGN(0、5、10、20、40μg/mL)加入BV2细胞中培养,分别检测培养液中IL-1β的水平。采用ELISA方法测定BV2细胞培养液中IL-1β的水平。结果 PGN、Aβ1-42寡聚体、PGN+Aβ1-42寡聚体均可激活BV2细胞分泌IL-1β,分泌IL-1β高峰分别为孵育后24h、12h、24h;孵育后6、12、24h同时间相比,PGN+Aβ1-42寡聚体组BV2细胞分泌IL-1β水平均较PGN组和Aβ1-42寡聚体组明显增多(均P<0.05);PGN激活BV2细胞分泌IL-1β的水平与PGN浓度有剂量依赖关系(P<0.05);丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190使BV2细胞分泌IL-1β量明显减少(P<0.01)。结论 PGN可激活BV2细胞分泌IL-1β,且促进Aβ刺激BV2细胞分泌IL-1β增多,p38MAPK抑制剂可抑制IL-1β分泌,推测p38MAPK可能参与BV2细胞分泌IL-1β的过程。     

低氧诱导因子1α过表达对PC12细胞在CoCl2拟缺氧模型中凋亡的影响

目的 研究CoCl2处理拟缺氧损伤条件下低氧诱导因子1α(HIF-1α)过表达对PC12神经细胞凋亡状态的影响.方法 分化后的PC12细胞分为2组,实验组转染pEGFPC1-HIF-1α△ODD表达质粒,对照组转染pEGFPC1.CoCl2处理模拟细胞缺氧损伤条件;Western blotting检测2组细胞常氧和缺氧时HIF-1α的表达;Hochest33342染色、流式细胞仪和Caspase-3活性检测3种方法观察神经细胞拟缺氧损伤时HIF-1α的过表达对细胞凋亡的影响.结果 50 μmol/L及100μmol/L CoCl2处理PC12细胞12 h、24 h可以诱导细胞拟缺氧损伤模型,实验组细胞常氧和缺氧时HIF-1α表达均高于对照组.Hochest33342染色结果提示实验组凋亡细胞明显少于对照组细胞.50 μmol/L CoCl2处理24 h后,流式细胞仪结果显示实验组细胞凋亡率为(5.41±3.29)%,对照组为(8.35±2.59)%,差异有统计学意义(P＜0.05).加入50μmol/LCoCl2处理12 h后,实验组细胞中Caspase-3活性的增加倍数明显低于实验组细胞.结论 适量CoCl2处理的神经细胞系拟缺氧损伤模型中,HIF-1α的过表达对细胞凋亡有显著的抑制作用.     

阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用。方法选用出生0~24hSprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养10d后用于实验。将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ1-42组:加入1.25μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5μmol/L)。应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达。Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变。结果与正常对照组比较,培养10d海马神经元经1.25μmol/L Aβ1-42作用48h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P0.01),而0.5、1.0、2.5μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P0.01)。免疫荧光及Western blot结果显示,1.25μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低。结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关。