组织工程化心肌组织构建的研究与问答

1 骨髓间充质干细胞分离培养方法的选择? 用于骨髓间充质干细胞分离的方法主要有4种:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法.目前最常用的分离培养骨髓间充质干细胞的方法是密度梯度离心后贴壁培养.根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度不同,将骨髓抽提物采用密度梯度离心,分离出处于1.073 g/mL密度界面上的细胞进行瓶皿接种,细胞贴壁生长,类似成纤维细胞,通过换培养基的方式除去悬浮生长细胞,可获得纯度高达95%的间充质干细胞.这种方法常与贴壁筛选法结合,操作简单,目前被认为是最理想的分离培养骨髓间充质干细胞的方法.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论.目的:体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能.方法:采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定.结果与结论:经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征.提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化.     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞.目的:体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性.方法:采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR 表达,并进行相关生物学特性鉴定.结果与结论:密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR.在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养

背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求.目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度.设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成.材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄.纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供.方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养.主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线.②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度.③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量.结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01).结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高.     

猪小肠黏膜下层与兔骨髓间充质干细胞的体外复合培养

背景：小肠黏膜下层细胞外基质材料免疫原性低,具有良好生物相容性,是构建单一结构工程化组织的较好支架材料。目的：观察体外兔骨髓问充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合培养的生物相容性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化培养兔骨髓间充质干细胞,在其接种前用红色免疫荧光标记,然后将第2代已标记的兔骨髓间充质干细胞接种在猪小肠黏膜下层上。结果与结论：①组织学观察：骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层上复合培养1周时细胞旱单层生长,荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞显示均匀红色荧光,复合培养2周细胞呈多层生长,并显示更密集的红色荧光。②扫描电镜观察：复合培养2d,骨髓间充质干细胞黏附于材料表面并伸展：复合培养1周,小肠黏膜下层被骨髓间充质干细胞分泌的胶原覆盖;2周后细胞在材料上已大量增殖形成融合,细胞连接紧密,细胞分泌大量基质,并分层。表明小肠黏膜下层与骨髓间充质千细胞具有良好的相容性。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要.目的:以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成.材料:SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增.取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红○染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力.结果:与密度梯度离心法相比,全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合索家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红○染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性.结论:采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法.经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞.     

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离免骨髓间充质干细胞

背景:特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化.但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提.目的:优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察.设计、时间和地点:观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成.材料:兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养.方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化.首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱肇的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可.按1.0X 108L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养.主要观察指标:间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.结果:①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构.②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞.③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱.④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞.结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强.     

两种体外分离成人骨髓间充质干细胞方法的比较

目的:目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞分离方法,虽然Percoll密度梯度离心法被认为是较经典的方法,但该方法操作较复杂.比较全骨髓培养法与常用的Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞的差异,以寻找一种简便、经济、实用的人骨髓间充质干细胞体外分离方法.方法:实验于2006-09/2007-06在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.实验材料:行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者骨髓由青岛大学医学院附属医院内分泌科提供,患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.实验方法:采用全骨髓培养法与Percoll密度梯度离心法从成人骨髓中分离骨髓间充质干细胞,比较两种方法所获得的贴壁细胞克隆数、细胞形态、细胞表面标志及向脂肪细胞的分化情况.结果:①全骨髓培养法获得的贴壁细胞克隆数明显多于Percoll密度梯度离心法(P < 0.05).两种方法获得的人骨髓间充质干细胞形态无明显差异,均为长梭形,克隆样生长.②免疫荧光显示,全骨髓培养法分离培养的第3代骨髓间充质干细胞 CD44阳性表达率和CD34 阴性表达率均略低于Percoll密度梯度离心法, 但两者之间的差异无统计学意义(t =2.639,P < 0.01).③两种方法获得的第3代骨髓间充质干细胞经地塞米松、胰岛素诱导后均可分化脂肪细胞.结论:与传统的Percoll密度梯度离心法比较, 全骨髓培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁较快,传代时间略早,细胞数量多.     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞。目的：体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性。方法：采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR表达,并进行相关生物学特性鉴定。结果与结论：密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR。在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论.目的:建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点.方法:采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线.于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色.结果与结论:采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞.对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P<0.05).实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性.说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞.     

Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

密度梯度离心并贴壁法分离成人骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的:观察密度梯度离心法结合贴壁法体外分离纯化培养人骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的成人骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法:实验于2005-05/09在中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院进行。用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜观察,噻唑兰法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。取体外扩增的第3代骨髓间充质细胞,以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中,每孔内加2mL含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基培养液。当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时,将培养基更换为含5%胎牛血清的低糖型DMEM培养液,其中含骨诱导剂地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油,浓度分别为:100nmol/L、0.25mmol/L、10mmol/L。间充质细胞在这样的诱导体系中进行诱导培养,对照只加培养基。在第4、8、12、16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化。体外加成骨诱导剂后分别作碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色和VonKossa染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化结果。结果:①分离的骨髓间充质干细胞培养48h后贴壁,72h后出现纺锤状细胞,贴壁的骨髓间充质细胞平均约12d后形成克隆。②第2代骨髓间充质干细胞99%表现为CD44 、Vim 、CD34-,CD29-。细胞表型稳定。③加成骨诱导剂后碱性磷酸酶活性明显增高,钙沉积在第8d就开始出现,茜素红染色、VonKossa染色阳性。结论:密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化的成人骨髓间充质干细胞纯度高,表型稳定,体外加成骨诱导剂培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可为骨组织工程和基因治疗提供比较理想的种子细胞。     

骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:随着近年来对骨质疏松机制研究的深入,研究者逐渐把研究重点放在了成骨细胞的来源骨髓问充质干细胞上.目的:对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞进行分离和体外培养,观察骨质疏松模型大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性,分析骨质疏松的细胞病理学机制,以期为骨质疏松的防治提供一个有意义的药物靶标.方法:选用10月龄SD雌性大鼠去卵巢增龄3个月来复制骨质疏松模型,设假于术对照组.运用密度梯度离心法对两组大鼠骨髓间充质千细胞进行分离和体外培养,运用扫描电镜对培养的骨髓间充质干细胞进行形态学观察,并行生长曲线及贴擘率检测.结果与结论:骨质疏松大鼠的骨髓间充质干细胞增殖能力明显下降.与对照大鼠相比存在许多结构特征的差异.体外实验结果表明,骨质疏松大鼠骨髓间充质千细胞的体外增殖能力下降可能是骨质疏松的细胞病理学机制.     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景:目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的:探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法:采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论:原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。