肝纤维化时转化生长因子-β1对凝血酶敏感蛋白-1的正向调节作用

目的 观察肝纤维化过程中转化生长因子(TGF)-β1对凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)合成的调节作用.方法 在从正常雄性Wistar大鼠获得的肝星形胶质细胞(HSC)中加入0、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/L 5种浓度的TGF-β1,采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中TSP-1 mRNA的表达及含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中TSP-1蛋白水平.结果 随着作用于HSC的TGF-β1浓度的升高,TSP-1的mRNA表达增高,TSP-1mRNA的表达与TGF-β1呈一定的量效关系.在TGF-β1浓度为2.5μg/L时表达值为(8.00±0.22)%,0.5μg/L时表达值为(1.98±0.14)%,当TGF-β1浓度由0.5增加至2.5μg/L时,TSP-1的mRNA表达上调;当TCF-β1浓度由2.5增加至5.0 μg/L时,TSP-1 mRNA的表达下调.TGF-β1浓度分别为0、0.5、2.5、5.0 μg,/L时,TSP-1蛋白表达值分别为(2.62±0.21)、(3.26±0.35)、(5.25±0.33)、(7.50±1.41)g/L.结论 TGF-β1对TSP-1合成具有正向调节作用.     

HBV-X蛋白对人肝癌细胞株SMMC-7721恶性表型的影响

目的 观察HBV-X蛋白对低侵袭性人肝癌细胞株SMMC-7721恶性表型的影响.方法 pcDNA3.1(-)-X重组质粒转染SMMC-7721细胞,以空质粒转染作对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),Western blot检测X蛋白表达水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液X蛋白、MMP-2、MMP-9、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)水平,并用体外功能实验观察转染前后的恶性表型的变化.结果 重组质粒转染SMMC-7721后X蛋白表达明显升高,细胞培养上清液HBV-X蛋白为(13.02±2.12)μg/L,对照组为(4.07±0.37)mg/L;MMP-2重组质粒转染组为(49.04±4.07)μg/L,对照组为(25.15±5.43)μg/L,MMP-9水平分别为(27.82±2.25)μg/L和(7.89±1.27)μg/L;uPA重组质粒转染组水平明显高于空质粒转染组,分别为(10.78±3.23)μg/L和(1.24±0.34)μg/L,t值分别为19.93,6.27;6.83,7.04,P值均<0.01.体外功能实验提示SMMC-7721转染HBV-X重组质粒后细胞黏附、运动和侵袭能力明显增强,细胞黏附率为(85.33±14.78)%,对照组为(57.34±2.52)%,t=2.96,P<0.05.运动试验透膜组胞数分别为(24.3±1.9)个和(12.3±2.5)个,t=4.89,P<0.05.侵袭试验透膜细胞数分别为(18.2±3.2)个和(9.3±2.3)个,t=4.29,P<0.05.而细胞增殖能力也明显增加.结论 HBV-X蛋白可能通过MMP-2、MMP-9、uPA分泌促进SMMC-7721的恶性表型.     

人肝癌细胞系HCCLM3中生长抑素受体亚型的表达研究

目的检测人肝癌高转移细胞系生长抑素受体mRNA和蛋白的表达,探讨生长抑素对肝癌细胞株增殖的影响及其作用机制.方法应用免疫组化和RT-PCR的方法检测人肝癌细胞系中五种生长抑素受体亚型的表达,并进行半定量分析;应用MTT法检测8肽生长抑素对肿瘤细胞增殖的影响.结果肝癌细胞HCCLM3中存在SSTR1-5表达.生长抑素抑制肝癌细胞株HCCLM3的增殖并呈浓度依赖性,其作用可以被PTP抑制剂正钒酸钠所抑制;HCCLM3细胞表达5种生长抑素受体的mRNA和蛋白,表达强度由强到弱依次为SSTR2、SSTR1、SSTR4、SSTR3、SSTR5.SSTR2和SSTR1的表达强度明显强于SSTR3、SSTR4、SSTR5（P＜0.05）,应用生长抑素后受体亚型SSTR2、SSTR3、SSTR5 mRNA表达强度明显高于SSTR1、4 mRNA（P＜0.05）.结论五种生长抑素受体亚型均存在于HCCLM3肝癌细胞系中,生长抑素可以明显抑制肝癌细胞的增殖.SSTR2 SSTR3、SSTR5和生长抑素结合后通过激活PTP抑制肿瘤细胞的生长和增殖.     

体外循环对血小板凝血酶敏感蛋白及纤维蛋白原含量的影响

目的　探讨体外循环心肺转流术 (CPB)期间血小板的灭活机制及临床意义。方法　用流式细胞术观察 40例先天性心脏病房、室间隔缺损患者在CPB下行心内修补术时的血小板凝血酶敏感蛋白 (Ts)及纤维蛋白原 (Fg)含量的变化 ,同时与本组患者试管内血小板Ts及Fg含量进行比较。结果　体外循环中血小板总数明显下降 ,从术前的 (310± 91)× 10 6/L降至术后的 (181± 44 )×10 6/L ,Ts及Fg含量均较术前有明显增加 (P <0 0 1) ,而试管内测定与之不符。结论　CPB期间Ts及Fg明显增加 ,表明Ts及Fg的粘附凝集功能增强 ,而凝血机制缺陷的原因可能与血小板总数下降、低温及肝素的后续作用有关。     

蛋白质组学技术分析肝癌细胞HCCLM3的细胞外蛋白降解组

目的:分析肝癌细胞系HCCLM3的细胞外蛋白降解组,筛选肝癌标记物。方法:凝胶电泳分离HCCLM3细胞外蛋白,线性离子阱-傅立叶变换离子回旋共振质谱(LTQ-FT-MS/MS)对其鉴定,数据库检索结合分子质量分析其降解组。免疫杂交定量骨桥蛋白(OPN)在正常、乙肝、乙肝肝硬化和肝癌4组血清中的表达。结果:HCCLM3细胞外蛋白电泳共测得51个条带,鉴定出1 405种非冗余蛋白,其中474种蛋白发生降解,且分泌蛋白的降解率最高(50%)。肝癌患者血清中OPN 20 kD片段明显高于其余3组(P<0.05),受试者工作特征曲线(ROC)显示AFP对肝癌诊断的曲线下面积(AUC)为0.79,OPN 20 kD片段的AUC为0.68,两者结合后能提高AUC至0.89。结论:凝胶电泳结合质谱技术研究肝癌蛋白降解组有效可行,骨桥蛋白20 kD片段可能对肝癌的诊断具有价值。     

RASSF1A基因表达对人肝癌细胞株QGY-7703生长的影响

目的观察RASSFlA基因的表达对人肝癌细胞株QGY-7703在体内外生长的影响。方法利用已构建成功的稳定表达RASSFlA基因的肝癌细胞株QGY-7703，通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、细胞周期的测定和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果以未转染的QGY-7703为对照，RASSFlA基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长速度，使肝癌细胞周期阻滞在G1／S期，显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目（P〈0．01）和大小，显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量（P〈0．01）。空载体的表达对肝癌细胞的生长影响不明显。结论RASSFlA的重表达抑制肝癌细胞在体内外的生长；RASSFlA基因是一个新的肝癌相关的抑癌基因。     

磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和侵袭力的影响

乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移仍然是导致患者预后不良的重要因素,明确乳腺癌的增殖和侵袭转移机制有助于找到针对其更好的治疗方法.我们应用磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信号通路抑制剂LY294002和Wortmanin处理乳腺癌细胞株MCF-7,以MTT和Transwell法检测处理后MCF-7细胞的增殖和侵袭力变化,探讨乳腺癌细胞中潜在活化的PI3K信号通路对其增殖和侵袭力的影响及意义.     

β1整合素反义寡核苷酸对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响

目的观察β1整合素反义寡核苷酸（ASODN）对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响。方法采用脂质体将不同浓度β1整合素ASODN转染到人胰腺癌BXPC-3细胞中，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western印迹法和Transwell侵袭室方法分别检测细胞β1整合素mRNA、蛋白表达水平及体外侵袭能力。结果与对照组相比，32～128mg／LASODN转染后可抑制β1整合素mRNA和蛋白的表达（P〈0．05），64mg／LASODN转染使BXPC-3细胞体外侵袭力明显下降（P〈0．05）。结论靶向β1整合素的ASODN可有效抑制其在人胰腺癌BXPC-3细胞中的表达。并降低癌细胞体外侵袭力。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制作用

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPSE)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN )对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制活性。方法　设计合成分别互补于HPSEmRNA 5 '未翻译区和起始密码区的AS ODN1、AS ODN2及相应对照NS ODN1、NS ODN 2 ,在脂质体介导下以 2 5 0nmol/L终浓度转染人乳腺癌MDA43 5细胞 ,以RT PCR和Westernblot分别检测HPSEmRNA和蛋白表达 ,以基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果　AS ODN 2组的HPSEmRNA相对表达量、蛋白表达量和侵袭细胞数(0 .62± 0 .0 4、12 .70± 1.70、61.0 0± 9.0 0 )与脂质体对照组 (1.60± 0 .0 4、3 6.2 0± 2 .10、178.0 0±17.0 0 )和NS ODN2组 (1.48± 0 .0 3、3 5 .5 0± 2 .3 0、174.0 0± 2 0 .0 0 )相比较均显著降低 (P <0 .0 1) ;而AS ODN 1组与脂质体对照组和NS ODN1组相比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　互补于起始密码区的HPSEAS ODN可通过下调HPSE表达显著抑制人乳腺癌细胞株MDA43 5的侵袭力。     

抗药性人肝癌细胞株的建立

以人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１为母细胞株．在体外通过逐渐增加抗癌药丝裂霉素（ＭＭＣ）浓度以共培养方式建立具有ＭＤＲ特性的人肝癌细胞株。与母细胞株相比较．该株对ＭＭＣ的抗药性增加了４．５倍。另外．通过对细胞培养各个阶段的ＭＤＲＩ基因表达情况的观察及用抗Ｐ－糖蛋白抗体ＭＲＫ１６证实．所建立的人肝癌细胞抗药株具有稳定性、较高的ＭＤＲ１基因表达特点。因此．该细胞株的建立．对肝癌化疗的研究提供了一个有用的模型。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

环孢素A及FK506对人肝癌细胞株增殖的影响

目的:探讨免疫抑制剂环孢素(CsA)及他克莫司(FK506)对肝癌细胞增殖的影响及可能机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法观察CsA及FK506对QGY鄄7701、QGY鄄7703、SMMC鄄7721和BEL鄄7402等4株肝癌细胞增殖的影响。还应用Hoechst33258荧光染料涂片,在荧光显微镜下观察用药组细胞的形态学改变。结果:随着作用时间延长,10μM的CsA对4株肝癌细胞均呈现明显的生长抑制效应(P<0.01),而0.5μM的FK506与对照组相比,其生长抑制作用不明显(P>0.05)。荧光显微镜下CsA用药组肝癌细胞呈现凋亡改变;而FK506用药组与对照组无显著差异。结论:免疫抑制剂CsA非但未促进体外肝癌细胞生长,相反呈明显的抑制效应。FK506尽管未呈现对肝癌细胞增殖的抑制效应,也未显示有生长促进作用。CsA对肝癌细胞的增殖抑制作用与诱导癌细胞发生凋亡有关。     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

不同侵袭能力人肝癌细胞株中caveolin-1的表达

目的:探讨不同侵袭能力人肝癌细胞株中caveolin-1的表达情况及意义.方法:应用免疫细胞化学、Western blot、RT-PCR和ELISA等技术检测人正常肝细胞株L02、肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中caveolin-1蛋白及mRNA的表达,同时检测各自血管内皮生长因子(vascular en-dothelial growth factor,VEGF)的表达.结果:caveolin-1蛋白和mRNA在正常肝细胞株中呈弱表达,在低侵袭肝癌细胞株中表达缺失,而在较高侵袭肝癌细胞株中表达显著上升,且与VEGF关系密切.结论:caveolin-1的表达与肝癌侵袭和血管生成有关,且在肝癌发生的不同阶段作用不同.     

siRNA沉默HYAL1基因表达对人乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的研究RNA干扰对透明质酸酶基因HYAL1的表达以及对人乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法体外化学合成HYAL1序列特异性双链RNA（dsRNA）,在脂质体（SiPORT Lipid）的介导下转染人人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA—MB-453S、ZR-75和ZR-75-30。荧光共聚焦显微镜下观察转染效率,RT—PCR分析HYAL1 mRNA的表达,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力。结果4种乳腺癌细胞株的HYAL1基因的表达均被HYAL1-siRNA有效封闭,HYAL1 mRNA相对水平明显降低（P〈0．05）。转染48h后4种人乳腺癌细胞的侵袭力均明显降低（P〈0．01）。结论HYAL1-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞株HYAL1基因的表达,降低人乳腺癌细胞的侵袭力。     

5-脂氧合酶抑制剂对人肝癌细胞株HepG2体外迁移及侵袭的影响

目的 :观察5-脂氧合酶(5-LOX)抑制剂对人肝癌细胞株HepG2体外迁移及侵袭的影响及其部分机制的探析。方法:将不同浓度5-LOX抑制剂体外培养人肝癌HepG2细胞,通过细胞迁移划痕愈合实验、侵袭实验法检测5-LOX抑制剂对细胞体外迁移、侵袭抑制的情况,同时利用Western blot法检测不同浓度5-LOX抑制剂干预后人肝癌HepG2细胞MMP-9蛋白的表达情况。结果:5-LOX在细胞质中表达,部分在细胞核也有表达,人正常肝细胞5-LOX弱阳性,肝癌细胞HepG2中5-LOX呈强阳性表达;5-LOX抑制剂各组各个时相点的划痕愈合率均显著低于空白对照组(P0.05),并且随着5-LOX浓度的增加降低的趋势逐渐明显;随着5-LOX抑制剂浓度的上调,对人肝癌HepG2细胞的抑制率逐渐上调;不同浓度5-LOX抑制剂可抑制MMP-9蛋白的表达,并随着浓度逐渐上调抑制作用更加明显。结论:5-LOX抑制剂可抑制人肝癌细胞株HepG2迁移及侵袭,这一过程可能与下调细胞MMP-9蛋白的表达有关。     

DNA损伤对前列腺癌细胞株BRCA1蛋白表达的影响

目的:探讨肿瘤抑制基因BRCA1对DNA损伤的反应中的重要作用。明确BRCA1蛋白除了受转录控制、磷酸化和蛋白相互间作用等机制调节外,其功能也受BRCA1的亚细胞分布的功能调节。方法:以乳腺癌细胞株作为阳性对照组,对前列腺癌细胞株LNCaP,DU145和PC-3的BRCA1亚细胞分布免疫荧光染色,并对BRCA1的表达量进行Western印迹检测。结果:BRCA1蛋白存在于LNCaP,DU145和PC-3的前列腺癌细胞株中,而且DNA损伤后能够引起其出核现象,即BRCA1蛋白在细胞质的细胞分布比例由14%增加到40%(P<0.01),相反在细胞核其分布比例由46%减少到21%(P<0.01)。BRCA1这种DNA损伤后的胞质亚细胞分布比例增高仅在p53野生型前列腺癌细胞株出现,在p53突变型前列腺癌细胞株没有此现象。形态学和Western印迹法证实,LNCaP细胞DNA损伤后BRCA1蛋白在胞质、胞核间互动后其凋亡比例高达40%,细胞凋亡的标记蛋白(裂解后caspase-3活性片段)也明显增高。结论:BRCA1的胞质胞核重新分布可能是DNA损伤后的蛋白功能调节机制之一;BRCA1这种亚细胞分布改变需要p53的功能调节,与p53的状态及其功能相关,同时也引起细胞凋亡比例的提高。在前列腺癌细胞株BRCA1引起更高比例的细胞凋亡现象预示,BRCA1可能成为前列腺癌临床治疗的生物靶点。     

TSA对人肝癌细胞株E-cadherin启动子区甲基化及表达的影响

目的 探讨去乙酰化转移酶抑制剂TSA对人肝癌SMMC-7721细胞株E-cadherin基因(E-cad)启动子区甲基化及其表达的影响.方法 TSA(300 nm/L)处理人肝癌SMMC-7721细胞,MTT法、TUNEL染色法分别检测细胞生长抑制及凋亡情况,甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MSP)检测处理前后E-cad启动子区CpG岛甲基化状态;Western blot检测处理前后E-cad及DNMT3b表达水平的变化.结果 TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长并诱导其发生凋亡,与对照组相比,实验组细胞生长抑制率为21.85%,对照组细胞凋亡率为(4.69±0.56)%,实验组凋亡率为(14.94±0.91)%,与对照组相比,凋亡细胞明显增多(P=0.000).用药前E-cad启动子区CpG岛为甲基化状态,E-cad蛋白表达阴性.TSA处理后E-cad启动子区CpG岛发牛脱甲基化,E-cad蛋白恢复表达.TSA亦导致DNMT3b的表达水平降低. 结论去乙酰化转移酶抑制剂TSA能抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长,并可诱导其发生凋亡,逆转E-cad基因启动子区的甲基化状态,并恢复该基因表达.TSA有可能通过DNMT3b发挥脱甲基化作用.     

化疗药和热休克对人肝癌细胞株SMMC—7721中MDR1基因表达的影响

以人肝癌细胞株ＳＭＭＣ—７７２１为模型，用化疗药丝裂霉素（ＭＭＣ），阿霉素（ＡＤＲ），卡铂（ＣＢＢＣＡ）和热休克处理后，观察其ＭＤＲ１基因的表达情况。结果发现，ＳＭＭＣ—７７２１细胞经ＡＤＲ处理后１周，ＭＤＲ１基因表达即增加，ＭＭＣ和ＣＢＢＣＡ处理后２周，ＭＤＲ１基因开始升高；而热休克处理后０．５ｈＭＤＲ１基因表达即见增高，在去除热休克因素后１ｈ这种增高的ＭＤＲ１基因表达开始降低。说明ＭＤＲ１基因表达不但受化疗药的影响，也可以通过热休克进行调节人肝癌细胞中ＭＤＲ１基因表达增加被认为是由于化疗药和热休克直接激活了ＭＤＲ１基因启动子所致。所以ＭＤＲ１基因也应是机体应激反应的主要基因之一。