投氟大鼠肾组织蛋白质组学的初步研究

目的探讨蛋白质组学技术在投氟所致大鼠肾组织蛋白质的整体表达变化研究中的价值，为氟中毒肾损害机制的研究提供新途径。方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦双向凝胶电泳方法，对投氟（100mg／L）8周和对照大鼠肾组织的蛋白质进行分离，使用Image master 2Delite图像软件分析电泳图谱．利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学有意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组大鼠肾组织蛋白双向电泳图谱上可观察到624个蛋白点．而投氟组肾组织双向电泳图谱上可见到776个蛋白点。与对照组比较，在投氟组大鼠肾组织表达明显改变的蛋白点经质谱鉴定出13种，主要是与细胞代谢、增殖和氧化应激相关的蛋白，其中11种蛋白表达增多，2种降低。结论本实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和分析肾整体蛋白点，并反映出投氟大鼠肾组织细胞代谢旺盛、增殖活跃和氧化应激明显的特点．表明蛋白质组学技术在氟中毒肾损害研究中具有实用价值。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究

目的 分析系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)蛋白质表达谱的变化.方法 分别抽取SLE患者及健康对照外周血,分离单个核细胞,抽提总蛋白,进行双向电泳、电泳胶银染显色,用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,寻找差异表达的蛋白质.利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白点.结果 对照组凝胶蛋白点匹配率为(71±4)%,患者组匹配率为(72±4)%.对照组凝胶共检出蛋白点(791±17)个,患者组检出(781±17)个.有11个蛋白点在SLE患者组表达上调,9个表达下调,质谱分析共鉴定5个蛋白.以前的研究显示,我们鉴定的部分蛋白在SLE的发病机制中起潜在的作用.结论 SLE患者外周血单个核细胞蛋白质表达发生了明显改变,为我们从淋巴细胞蛋白质谱变化的整体角度上阐明SLE发生的分子机制及免疫调控通路奠定了基础.     

约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析

目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白。方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIORAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱。凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性。未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀。选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织。疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等。结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关。     

不同剂量氟对大鼠成骨细胞激活与BMP-4、BMP-2和Smad-4表达的影响

目的探讨过量氟对大鼠成骨细胞系BMP-2、BMP-4及其信号转导物Smad-4表达水平的影响及其与氟骨症发病机制的关系。方法利用饮水加入氟化钠(NaF)进行大鼠染氟实验,采用原位杂交技术、 Western blot技术、免疫组织化学方法,对氟中毒大鼠骨组织成骨细胞系进行BMP-4、Smad-4的mRNA水平和 BMP-2、BMP-4蛋白质水平的定量分析。结果 NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖,并诱导 BMP-2、BMP-4和Smad-4的表达。在低钙偏食组慢性氟中毒大鼠BMP-4、Smad-4 mRNA和BMP-2、BMP-4 蛋白质水平稍增高但与对照组相比差异无统计学意义(P>0．05);在高钙和低钙加氟组Smad-4 mRNA的表达均增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0．001);在低钙加氟组Smad-4 mRNA水平与BMP-4 mRNA水平和BMP-2、BMP-4蛋白质表达水平具有一定相关性(r=0．53)。结论过量氟可刺激大鼠成骨细胞系激活、增殖能力增强,但在增殖能力增强的成骨细胞中BMP-4 mRNA和BMP-2、BMP-4蛋白质水平表达无明显增高,可能与氟骨症的骨化不良有关;NaF刺激Smad-4 mRNA过表达可能与氟骨症骨相损害的信号转导途径激活有关。     

低温胁迫下淡色库蚊体内蛋白表达的双向电泳分析

目的 探索低温胁迫对淡色库蚊体内蛋白质表达的影响。 方法 以室内饲养淡色库蚊为对照,利用双向 电泳技术,比较低温处理后淡色库蚊体内蛋白质表达谱的差异。 结果 处理组和对照组蛋白质浓度分别为 8. 5 μg / μL 和 4. 76 μg / μL,二者差异有统计学意义(P<0. 05)。 经双向电泳分析,共发现 2 倍差异蛋白点 77 个,低温处理组 表达量上调的蛋白点 30 个,表达量下调的蛋白点 47 个;低温处理组特有蛋白点 14 个,分子量主要在 25 ~ 60 kDa 之 间。 共鉴定出 25 个差异表达蛋白质,主要与细胞骨架的重塑、糖代谢、能量代谢以及各种合成酶和代谢酶有关。 结论 低温处理可诱导淡色库蚊体内蛋白质的表达变化,对差异蛋白的进一步分析有望获得淡色库蚊的抗冻蛋白。     

荧光差异双向凝胶电泳法筛选大鼠脑缺血相关蛋白

目的 鉴定局灶性脑缺血相关蛋白并筛选早期神经保护蛋白.方法 应用先进的差异蛋白质组学荧光差异双向凝胶电泳（2D DIGE）技术,比较大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）6 h病灶侧大脑皮层和正常大鼠相应部位蛋白质变化;采用DeCyder-DIA软件、单因素方差分析ANOVA,选择两组间蛋白表达量差异具有统计学意义（P＜0.05）且AR＞1.4的蛋白点;基质辅助激光解析/电离-飞行时间（MALDI-TOF）质谱鉴定差异蛋白.结果 脑缺血6 h组与正常对照组比较13个蛋白点符合统计学要求;经质谱分析仅鉴定出一个缺血组明显减少的蛋白点为α-微管蛋白.结论 作为结构蛋白之一的α-微管蛋白在脑缺血早期即发生明显变化,是缺血性脑血管病早期相关蛋白.     

新生小鼠肠边缘群细胞蛋白质组的差异蛋白分析

[目的]筛选肠道干细胞特征的差异蛋白质或蛋白质群。[方法]采用双向凝胶电泳方法分离新生小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞总蛋白,选择差异表达超过1.5倍的蛋白质进行质谱分析及数据库搜索、鉴定。[结果]成功建立小鼠肠边缘群细胞与肠上皮细胞的双向电泳图谱,筛选出差异蛋白点39个,质谱分析及数据库搜索共鉴定出32种蛋白质。[结论]小鼠肠干细胞与上皮细胞的蛋白表达谱存在差异,鉴定出的32种蛋白质有可能成为潜在的、有应用价值的肠道干细胞鉴别分子标志。     

氟对大鼠成骨细胞骨保护蛋白表达的影响

目的 观察氟对体外培养大鼠乳鼠成骨细胞骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)mRNA和蛋白表达的影响.方法 体外培养Wistar大鼠乳鼠成骨细胞,按染氟剂量分为0(对照)、1、2、4 mg/L组.分别在染氟48、72 h后提取RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测OPG mRNA表达;采用酶连免疫吸附实验(ELISA)法检测培养液上清中的OPG蛋白表达.结果 大鼠乳鼠成骨细胞在体外染氟培养48、72 h,OPG mRNA表达组间比较差异均有统计学意义(F值分别为333.48、808.34,P<0.05).在染氟48 h,1、2、4 mg/L组OPGmRNA表达(0.810±0.043、0.819±0.031、0.870±0.044)与对照组(0.800±0.040)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);在染氟72 h,1、2、4 mg/L组(0.933±0.047、1.031±0.051、1.240±0.062)高于对照组(0.805±0.020),差异均有统计学意义(P<0.05);OPGmRNA表达,72 h均高于48 h,染氟剂量和染氟时间有交互作用(F=204.16,P<0.05).在染氟培养48、72 h,OPG蛋白表达组间比较差异均有统计学意义(F值分别为7.49、41.31,P<0.05);组间两两比较,仅4 mg/L组(0.228±0.014、0.277±0.048)与对照组(0.205±0.012、0.229±0.010)比较,差异有统计学意义(P<0.05);OPG蛋白表达虽然72 h均高于48 h,但染氟剂量和染氟时间无交互作用(F=1.21,P>0.05).结论 氟可促进成骨细胞OPG mRNA和蛋白表达,这种作用与染氟的剂量以及作用时间有关.     

蛋白质组学技术对PC12细胞的热休克蛋白的鉴定

目的 使用蛋白质组学技术鉴定大鼠肾上腺皮质细胞瘤细胞系PC12细胞内的热休克蛋白质.方法 提取PC12细胞的蛋白质,建立固相pH梯度双向电泳图谱,应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Elite分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息,挑选匹配良好的高峰度蛋白点,进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析,鉴定.结果 用二维电泳技术分离,并用MALDI-TOF-MS 成功鉴定出5个PC12细胞的热休克蛋白.结论 PC12 细胞蛋白质组中热休克蛋白胶图位点的建立,为探讨HSP在神经系统疾病发病中的作用奠定了基础,并提供了新的候选治疗靶点.     

染氟大鼠成骨细胞内钙调蛋白表达的变化

目的观察不同浓度的氟对体外培养大鼠成骨细胞内钙调蛋白(CaM)表达的影响。方法采用骨组织块法分离培养新生Wistar大鼠颅骨成骨细胞,然后将不同浓度的氟作用于大鼠成骨细胞,染氟培养48 h后,采用半定量RT-PCR方法分析CaM基因的表达,免疫细胞化学法检测CaM蛋白的表达,采用生物化学的方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、超氧阴离子自由基、丙二醛(MDA)的含量。结果与对照组比较,各氟组CaM基因及蛋白的表达均显著增加;与对照组相比,各氟组成骨细胞内SOD含量明显降低,超氧阴离子自由基含量明显增高,差异均具有统计学意义,而MDA含量无明显变化。结论氟在一定浓度范围内可引起培养成骨细胞的SOD含量明显降低、超氧阴离子自由基含量明显增高,且对成骨细胞的CaM蛋白的表达具有促进作用。     

Comparative proteomics analysis of human gastric cancer

AIM： To isolate and identify differentially expressed proteins between cancer and normal tissues of gastric cancer by two-dimensional electrophoresis （2-DE） and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. METHODS： Soluble fraction proteins of gastric cancer tissues and paired normal tissues were separated by 2-DE. The differentially expressed proteins were selected and identified by MALDI-TOF-MS and database search. RESULTS： 2-DE profiles with high resolution and reproducibility were obtained. Twenty-three protein spots were excised from sliver staining gel and digested in gel by trypsin, in which fifteen protein spots were identified successfully. Among the identified proteins, there were ten over-expressed and five under-expressed proteins in stomach cancer tissues compared with normal tissues. CONCLUSION： In this study, the well-resolved, reproducible 2-DE patterns of human gastric cancer tissue and paired normal tissue were established and optimized and certain differentially-expressed proteins were identified. The combined use of 2-DE and MS provides an effective approach to screen for potential tumor markers.     

铜绿假单胞菌相关性肺损伤的蛋白质差异表达研究

目的 利用蛋白质组学方法筛选铜绿假单胞菌急性肺损伤特异相关蛋白质,为鉴别诊断感染与非感染因素引起的急性肺损伤提供理论依据.方法 建立感染(铜绿假单胞菌急性肺损伤)与非感染(包括机械通气急性肺损伤、油酸急性肺损伤)大鼠模型,应用双向凝胶电泳技术分离总蛋白,Image Master双向凝胶电泳软件分析差异表达蛋白质点后,应...     

燃煤污染型砷中毒肝损伤患者血清差异蛋白质的筛选

目的 对比分析燃煤污染型砷中毒肝损伤患者和健康人血清中差异表达的蛋白,筛选与燃煤污染型砷中毒致肝损伤发生密切相关的血清蛋白质.方法 6例血清标本来自于贵州省兴仁县交乐病区燃煤型砷中毒肝损伤患者及病区健康人(对照组),采用双向凝胶电泳(2-DE)分离血清中总蛋白,硝酸银染色后经图像分析识别差异表达的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时问质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质点,寻找与燃煤污染型砷中毒致肝损伤有关的蛋白质.结果成功地建立了血清2-DE图谱.差异蛋白分析显示,砷中毒肝损伤组平均蛋白点数为(824±31)个,对照组为(782±42)个,两组血清2-DE图谱的匹配率为94.9%(782/824).筛选出两组间的差异蛋白点49个,对其中表达量差异3倍以上的30个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,鉴定出相关蛋白10个.与对照组比较,其中α2-巨球蛋白、B细胞受体相关蛋白31、细胞角蛋白1、载脂蛋白A-I在砷中毒肝损伤组表达上调,触珠蛋白、α2-HS-糖蛋白、细胞外信号调节激酶4、锌指蛋白323、ZAP-70、SP40表达下调.结论成功地建立了分辨率高、重复性较好的燃煤污染型砷中毒肝损伤患者血清2-DE图谱,并筛选出一些与健康人血清中差异表达的蛋白质,这些蛋白质能否作为燃煤污染型砷中毒肝损伤诊断的血清标志物还有待于进一步验证.     

乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组之间的差异,鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,对12例肝细胞癌患者的肝细胞癌组织与肝硬化组织的蛋白质进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果经肝细胞癌绀织与癌周组织的差异对比分析,共发现有表达水平存在显著差异的35个蛋白质点,14个差异蛋白质点得到了初步鉴定,其中5个蛋白质既往文献中曾报道其与肝细胞癌变相关。结论HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与肝硬化组织蛋白质组之间存在差异;本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质,可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。     

大鼠急性肺栓塞血清差异表达蛋白的研究

目的研究急性肺栓塞（APE）大鼠血清和正常大鼠血清的差异蛋白表达变化。方法采用血栓颈静脉注入法制备大鼠APE模型,采用双向电泳技术找出差异蛋白,用MALDI-TOF技术和生物信息学技术鉴定差异蛋白,并对部分差异表达蛋白采用Western-blot技术作进一步验证。结果大鼠血清蛋白的2-DE胶银染可分离出1 400多个点,考染可达到1 200个点以上。经图像分析得到的24个差异表达蛋白中有12个蛋白得到鉴定。对部分差异蛋白采用Western-blot方法在蛋白水平的验证结果与2-DE结果基本相符。结论采用比较蛋白质组学的方法可以发现APE大鼠血清中的差异表达蛋白,这些差异表达蛋白分子将为我们寻找新的APE血清学标志物提供重要的线索和依据。     

Differentially expressed proteins of gamma-ray irradiated mouse intestinal epithelial cells by two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry

AIM: To identify the differentially expressed proteins involved in ionizing radiation in mice and to explore new ways for studying radiation-related proteins.METHODS: Bal B/c mice grouped as sham-irradiation, 3h and 72 h irradiation were exposed to 9.0Gy single dose of γ-irradiation. Intestinal epithelia were isolated from mice,and total proteins were extracted with urea containing solution. A series of methods were used, including twodimensional electrophoresis, PDQuest 2-DE software analysis, peptide mass fingerprinting based on matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and SWISS-PROT database searching, to separate and identify the differential proteins.Western blotting and RT-PCR were used to validate the differentially expressed proteins.RESULTS: Mouse intestine was severely damaged by 9.0 Gy γ-irradiation. Tmage analysis of two-dimensional gels revealed that averages of 638±39, 566±32 and 591±29 protein spots were detected in 3 groups, respectively, and the majority of these protein spots were matched. About 360 protein spots were matched between normal group and 3 h irradiation group, and the correlation coefficient was 0.78 by correlation analysis of gels. Also 312 protein spots matched between normal group and 72 h irradiation group, and 282 protein spots between 3 h and 72 h irradiation groups. Twenty-eight differential protein spots were isolated from gels, digested with trypsin, and measured with MALDI-TOF-MS. A total of 25 spots yielded good spectra, and 19 spots matched known proteins after database searching. These proteins were mainly involved in anti-oxidation, metabolism, signal transduction,and protein post-translational processes. Western-blotting confirmed that enolase was up-regulated by γ-irradiation. Upregulation of peroxiredoxin ! was verified by applying RTPCR technique, but no change occurred in Q8VC72.CONCLUSION: These differentially expressed proteins might play important roles when mouse intestine was severely injured by γ-irradiation. It is suggested that differential proteomic analysis may be a useful tool to study the proteins involved in radiation damage of mouse intestinal epithelia.     

溃疡性结肠炎血清差异蛋白的筛选研究

目的 应用蛋白质组学寻找溃疡性结肠炎(UC)血清差异蛋白,初步探索UC可能的生物标志物.方法 收集UC患者30例和健康对照者30名的血清标本,双向凝胶电泳(2-DE)分离等量混合血清的蛋白质,运用图像分析软件进行比较和分析,识别差异表达蛋白质.应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质点.结果 UC组和对照组之间年龄、体重指数、吸烟情况和饮酒量的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).初步筛选出UC患者与健康对照者存在明显差异的39个蛋白点,选择其中9个点,经质谱分析发现触珠蛋白、热休克转录因子2、受体酪氨酸激酶、醛脱氢酶、载脂蛋白C-Ⅲ、中心粒旁物质1在UC患者中表达水平升高,角蛋白1、细丝蛋白A结合蛋白1、肌球蛋白3在UC患者中表达水平降低.结论 采用蛋白质组学2-DE和质谱技术,筛选并鉴定出与UC相关的9个血清蛋白质,为提供新的UC生物学行为研究分子标志物奠定基础.     

Identification of proteins of human colorectal carcinoma cell line SW480 by two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry

AIM: To conduct the proteomic analysis of human colorectal carcinoma cell line, SW480 by using two-dimensional electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption /ionization-time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS).METHODS: The total proteins of human colorectal carcinoma cell line, SW480 were separated with 2-DE by using immobilized pH gradient strips and visualized by staining with silver nitrate. The gel images were acquired by scanner and 2-DE analysis software, Image Master 2D Elite. Nineteen distinct protein spots were excised from gel randomly and digested in gel by TPCK-trypsin. Mass analysis ofthe tryptic digest peptides mixture was performed by using MALDI-TOF MS. Peptide mass fingerprints (PMFs) obtained by the MALDI-TOF analysis were used to search NCBI,SWISS-PROT and MSDB databases by using Mascot software.RESULTS: PMF maps of all spots were obtained by MALDI-TOF MS and thirteen proteins were preliminarily identified.CONCLUSION: The methods of analysis and identification of protein spots of tumor cells in 2-DE gel with silver staining by MALDI-TOF MS derived PMF have been established.Protein expression profile of SW480 has been obtained.It is demonstrated that a combination of proteomics and cell culture is a useful approach to comprehend the process of colon carcinogenesis.     

A glycoproteome database of normal human liver tissue

Purpose To extensively investigate the glycoproteins of normal human liver tissue, constructing the glycoprotein profile and database of the normal human liver tissue. Methods The total proteins were extracted from the normal human liver tissue and then subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE). Finally, 2-DE gels were stained according to the methods of multiplexed proteomics (MP) technology. Glycoprotein spots were excised from 2-DE gel and then characterized by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Results The PDQuest software detected 1,011 glycoprotein spots and 1,923 total protein spots in the 2-DE gels of sample from the normal human liver tissue. Furthermore, 116 species of glycoproteins were successfully identified via peptide mass profiling using MALDI-TOF-MS/MS and annotated to our databases. In addition, we also applied bioinformatics softwares to predict N- or O-glycosylation sites of identified glycoproteins. Conclusion This study demonstrates the feasibility of a novel technological platform to contruct glycoprotein databases. These results lay the foundation for future physiological and pathological studies of the human liver.     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.