Jagged1蛋白在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达差异

目的Jagged1蛋白在大鼠肌源性干细胞（MDSCs）体外增殖分化为神经样细胞过程中的表达差异研究。方法大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为2组：对照组完全培养基培养,诱导组加入诱导剂诱导。6d后观察2组细胞的形态变化,并进行NSE免疫细胞化学鉴定。然后通过免疫荧光观察Jagged1蛋白的表达差异。结果诱导组细胞NSE染色阳性,免疫荧光结果显示对照组Jagged1蛋白表达阳性,实验组基本不表达。结论大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Jaggedl蛋白表述存在明显差异。     

成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法。方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin( ),CD34( ),CD45(-),Sca1( )。结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

大鼠脂肪源性干细胞定向分化为施万细胞样细胞的实验研究

目的 研究体外培养成年大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)并诱导分化为施万细胞样细胞的潜能.方法 分离、培养成年SD大鼠ADSCs,免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原CD44,CD49d和CDl06.传6～8代的ADSCs接种在多聚赖氨酸铺板的培养板内.用含5 ng/nd血小板源性生长因子,10 ng/ml牛碱性成纤维细胞生长因子,14 μmol/L Forskolin,200ng/ml Heregnlin及10%FBS的DMEM/F12培养基诱导分化12 d,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物GFAP,S-100和P75.结果 分离纯化的ADSCs呈CD44和CD49d阳性,而CD106表达为阴性;诱导后的细胞呈梭形,并表达施万细胞特异性标志蛋白-GFAP,S-100和P75.结论 从大鼠脂肪组织能获得具有增殖和分化潜能的干细胞,这些细胞在特定条件下可定向诱导分化为施万细胞样细胞.     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养及诱导分化

目的 建立一株能在体外长期培养并具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞(HBMSC)。方法 利用差异贴壁法从人肋骨中分离纯化HBMSC,在体外通过地塞米松、胰岛素诱导分化为脂肪细胞,用VitC、β-磷酸甘油、地塞米松诱导下可分化成骨细胞,裸鼠体内分化为软骨样细胞及成骨样组织,采用流式细胞仪检测细胞表面CD31、CD34、CD45、CD9、CD90、CD105和CD106。以2.5×10~7细胞接种于裸鼠皮下进行致瘤实验,用DY-NAL REU-SSO反向杂交法检测HLA。结果 细胞已连续培养超过30代仍能稳定生长,细胞表面特性为CD105、CD106阳性,而CD31、CD34、CD45、CD9、CD90为阴性。在体外能诱导成脂肪细胞、成骨细胞。无致瘤性,在裸鼠体内能形成软骨细胞及骨样组织。结论 培养了一株能在体外长期培养及具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞。     

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法.方法 采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞,经差速贴壁法纯化后,培养液中培养.倒置显微镜观察细胞形态,生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞.结果 经过两步消化和差速贴壁后, 成功培养出高纯度的肌源性干细胞,细胞免疫荧光结果为desmin( ).结论 通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定,为组织工程的临床应用提供种子细胞.     

利用中性蛋白酶消化法扩增毛囊干细胞的实验研究

目的完善毛囊干细胞的体外培养扩增体系。方法接种毛囊干细胞于滋养层细胞上,利用中性蛋白酶分离毛囊干细胞和滋养层细胞传代,进行鉴定并计算扩增数目。结果经中性蛋白酶传代后,毛囊干细胞生长良好,可连续培养至15代;第12代(P12)毛囊干细胞免疫细胞化学检测均表达K15、β1-整合素及p63,原代(P0)至P12毛囊干细胞均表达K15 mRNA。以P10计算,细胞数量为1.2×1036,约250 m2,满足构建的需要。结论通过滋养层接种毛囊干细胞结合中性蛋白酶消化法传代,可大量扩增毛囊干细胞。     

大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究

目的:探索和建立大鼠肠神经干细胞分离与体外培养的方法.方法:取胎龄20 d的SD大鼠肠道,剥取含有肌间神经丛的外纵肌,并以胶原酶消化,获得单细胞悬液;接种单细胞悬液到改良的肠神经干细胞培养液,置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养,待神经球出现后进行免疫学鉴定,并观察培养细胞的部分生物学特性.结果:培养第2天有细胞集落形成,第10天左右出现肠神经球;免疫细胞化学染色显示Nestin阳性,已分化的肠神经球免疫双染示TUJ-1、GFAP阳性.结论:初步建立了肠神经干细胞分离与体外培养方法,为下一步肠神经干细胞的移植应用奠定基础.     

肌源性干细胞移植修复糖尿病胰岛功能的旁分泌机制研究

目的阐明肌源性干细胞移植修复糖尿病小鼠胰岛功能的旁分泌机制及参与胰岛修复的信号通路。方法取6只大鼠的前肢肱三头肌与后肢腓肠肌,采用差速贴壁法纯化扩增大鼠肌源性干细胞,传至第4代用于移植。取40只大鼠,通过尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,32只成功造模,取24只随机均分为3组：实验a组胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个,实验b组胰腺被膜下移植（LY294002（10umol/L）＋MD-SCs2×106）,模型对照组同法给予等量不含细胞的培养液。余8只大鼠作为正常对照组。结果血糖变化：移植后1周,实验a组血糖出现显著下降并一直持续下降至第4周,与模型对照组比较差异有统计学意义。胰岛细胞和胰岛β细胞数变化：移植后4周模型对照组胰岛数目仍较少,胰岛β细胞也较少,实验a组小鼠胰岛数目增加,胰岛β细胞数目也增加,与模型对照组比较差异有显著统计学意义。Western Blotting检测发现实验a组pAKT表达显著上调,加入LY294002后即使加入MDSCs后也不能上调pAKT。结论肌源性干细胞移植在糖尿病大鼠胰腺被膜下对胰岛功能有修复作用。     

黑色素瘤细胞系HME1的建立及其生物学特性分析

目的：建立一株黑色素瘤细胞系,并分析其体外生物学特性。方法：取黑色素瘤活检组织进行组织块法原代培养,待长满90%后,消化传代培养并进行生长动力学、形态学及致瘤性等生物学特性鉴定。结果：该细胞系已在体外培养生存18个多月,传90余代。其生物学特性如下：该细胞系接种至裸鼠后可致瘤,其移植瘤细胞形态与原实体瘤相似;检测第20代细胞生长曲线,其倍增时间为56.9 h;第20代细胞软琼脂集落形成率平均为19.1%;染色体核型分析为非整倍体,众数为 92条;透射电镜下可观察到细胞表面有丰富的微绒毛、核糖体及黑色素颗粒;SP免疫组化分析显示,细胞有HMB-45表达。结论：该黑色素瘤细胞经体外培养后已永生化,形成了连续传代细胞系,具有黑色素瘤恶性表型的特征。     

端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达

目的: 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法: 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞,白血病抑制因子(LIF)抑制细胞分化,于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析,同时检测无LIF抑制下,第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果: 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态,该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论: 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老.     

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。     

人胎肺克隆形成细胞在恶性转化研究中的意义

将5,6月龄人胎肺细胞连续接种于半固体琼脂,发现:克隆形成率与培养时间及传代次数成反比。分离到的克隆形成细胞离体培养寿命延长,部分失去接触抑制,可能是致癌物引起恶性转化的主要靶细胞。     

体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究

目的 分离、纯化慢性粒细胞性白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（MSC）,并对MSC进行功能、特性鉴定。方法 获取CML患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增;流式细胞术检测MSC免疫表型和细胞周期;通过油红O染色、Von Kossa染色和Western印迹检测MSC向脂肪、骨和神经细胞的分化。电镜检测CML患者骨髓MSC的超微结构;通过软琼脂培养法和裸鼠接种,确定CML来源的MSC是否存在致瘤性。结果 MSC在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪和神经细胞分化。CML来源的MSC在倒置显微镜下为梭形,表达CD29、CD44、CDl05,而CDllb,CD31、CD34、CD45、HLA—DR均为阴性。CML来源的MSCBCR／ABL融合基因阴性,不具备体内和体外致瘤性。结论CML患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSC,该细胞群体不具备体外和体内致瘤性,表现为正常MSC的生物学特征。     

骨髓间充质干细胞性状稳定性与生物安全性研究

目的:探讨长期体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学性状稳定性与应用安全性。方法:采集大鼠骨髓细胞用原代贴壁培养法获取大鼠BMSCs,进行长期体外传代培养后行流式细胞术检测第4、20和40代细胞周期变化和特异表面标志抗原表达改变;利用血清依赖实验和软琼脂克隆形成实验检测不同培养时期BMSCs成瘤潜能;以鼠源性C6胶质瘤细胞系为阳性对照,SD大鼠颅内种植等细胞数量BMSCs,MRI与鼠脑病理切片检测BMSCs体内成瘤性。结果:采用原代贴壁培养法获取稳定传代大鼠BMSCs,流式细胞周期分析显示BMSCs随传代次数增加细胞增殖速度有所增快,但流式细胞术表面标志抗原表达无明显改变;血清依赖实验和软琼脂克隆形成实验显示BMSCs较C6胶质瘤细胞系表现出极差的低营养耐受能力和半固体介质克隆形成能力;MRI与鼠脑病理切片未检测到BMSCs在体内的肿瘤形成。结论:长期体外培养的大鼠BMSCs生物学性状稳定,无致瘤潜能,体内移植相对安全。     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

人胃肠间质瘤细胞系的建立及其生物学特性

目的：从切除的人小肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GIST)组织建立一株间质瘤细胞系,初步鉴定其生物学特性。方法：取人小肠间质瘤组织切成小块,置于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素和庆大霉素的RPMI 1640培养基中进行培养,待细胞长满90%汇合面后消化传代培养,并进行形态学、生长动力学、免疫组织化学（免疫组化）及致瘤性等生物学特性研究。结果：成功建立GIST细胞系,命名为GIST-H1 细胞系。该细胞系已在体外培养生存1年,传60余代。免疫组织化学分析显示该细胞CD117（+）,SMA（+）,dog-1（+）,CD34（-）及S-100（-）;该细胞系体外生长的倍增时间为47.5 h;软琼脂集落形成率为24.8%;透射电镜下可观察到该细胞富含线粒体和内质网,多数细胞表面无绒毛,胞核呈卵圆形;染色体核型分析为非整倍体,众数为60~98条;该细胞接种至裸鼠皮下后致瘤性为100%。结论：间质瘤细胞系在体外长期培养后已永生化,形成了可连续传代的细胞系,且具有明显的间质瘤细胞恶性表型特征。     

毛囊球部细胞体外在胶原/壳聚糖多孔支架上形成皮肤样结构的研究

目的:观察毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上皮肤重建情况.方法:采用细胞培养技术和细胞支架种植技术,将培养的毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上,HE染色观察皮肤样结构形成情况,并作免疫组织化学鉴定,以证明细胞的来源属性.结果:毛囊球部细胞种植到胶原/壳聚糖多孔支架上可见皮肤样结构形成,表皮部分细胞分化良好,排列复层整齐,有角化现象,高分子与低分子角蛋白表达阳性.结论:低传代培养的毛囊球部细胞在体外胶原/壳聚糖多孔支架上可诱导皮肤样结构形成.