结核分枝杆菌PZase-GST融合蛋白表达与鉴定

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌pncA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核杆菌pncA基因,并构建到pGEX4T-1上。重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果与预期大小相似,PCR扩增出大约600 bp的pncA基因,并且吡嗪酰胺酶(PZase)在诱导后得以高效表达。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-pncA,并经诱导后高效表达了PZase融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺(PZA)耐药性奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达与纯化及免疫原性检测

目的构建及鉴定含有GST标签的结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法 PCR扩增结核分枝杆菌esat-6基因,并构建到pGEX4T-1上,重组质粒经测序鉴定后进行诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌esat-6基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体pGEX4T-1-ESAT-6,并经诱导后高效表达了ESAT-6融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立

目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性。结果扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体p GEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

结核分枝杆菌毒力基因片段Rv0450c分子克隆及原核表达

目的通过分子克隆的方法对结核分枝杆菌H37Rv中编码MMPL4蛋白的Rv0450c基因以及编码该蛋白一个161氨基酸的膜内区域(I161)和一个371氨基酸的膜外区域(O371)的基因片段在大肠杆菌中的表达和纯化方法进行研究,为进一步探讨MMPL4与结核分枝杆菌耐药相关功能性研究以及抗体制备提供依据。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv0450c基因片段,并克隆到原核表达载体pET28b质粒中,获得的重组质粒转化原核表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达,并进行纯化。结果从结核分枝杆菌基因组H37RvDNA中成功扩增出Rv0450c基因及编码I161/O371的DNA片段,并构建原核表达质粒pET28b-Rv0450c,pET28b-I161和pET28b-O371重组MMPL4蛋白和I161在大肠杆菌中表达不明显,而膜外区域O371以包涵体形式高表达。结论 Rv0450c基因原核表达质粒可以成功构建并在大肠杆菌内较好表达,为进一步MMPL4功能研究和抗体制备打下良好基础。     

人肺癌相关基因HLCDG1在大肠杆菌中的表达

目的构建新克隆的肺癌抑瘤基因候选者HLCDG1的融合表达质粒pGEX-6P-1/HLCDG1并在原核表达系统中表达。方法采用多聚酶链式反应(PCR)扩增HLCDG1基因蛋白编码序列,将该片断插入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL-21扩增。构建的融合表达质粒经酶切和测序鉴定后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色和W estern b lot鉴定实验结果。结果构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中经IPTG诱导出一条分子量约为46kD的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,W estern b lot鉴定其为GST-HLCDG1融合蛋白。结论HLCDG1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中有效表达,为进一步研究该蛋白质的结构和功能奠定研究基础。     

麻疹病毒血凝素基因在大肠杆菌中的原核表达

目的构建麻疹病毒(measles virus)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒,使其在大肠杆菌中大量表达H蛋白,为制备重组蛋白用于免疫检测奠定基础。方法提取麻疹病毒Leningrad-4株总RNA,RT-PCR法扩增其血凝素基因。克隆入pGEM-Teasy载体,双向测序,测序正确后将Ha基因用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后亚克隆至pET28a(+)载体,转化BL21(DE3)。培养后用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分离大肠杆菌蛋白,分析H基因表达情况。HisLink树脂纯化目的蛋白用于建立酶联免疫吸附反应,进行血清抗体水平检测。结果扩增了麻疹血凝素基因,与麻疹Leningrad-4株血凝素基因同源性达99.8%,构建了重组血凝素基因的原核表达质粒并进行了诱导表达和SDS-PAGE凝胶电泳,在66 kD处有表达的重组血凝素蛋白条带。结论成功构建了麻疹血凝素基因的表达载体并在大肠杆菌中进行了诱导表达,建立了利用重组血凝素蛋白检测IgG的ELISA方法。     

重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化

目的构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件。方法用化学合成法合成多价人精子表位肽基因。该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响。结果构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体。在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5 h。优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,且主要以可溶形式表达。结论成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21(DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量。     

结核杆菌Edman株Ag85C基因的克隆表达与鉴定

目的克隆人结核杆菌Ag85C基因并在大肠杆菌中表达,研究其对结核病预防和治疗过程中的免疫保护作用。方法设计一对特异性引物,PCR扩增人结核杆菌Edman株Ag85C基因开放阅读框并定向克隆到原核表达载体pQE30,通过酶切、PCR和测序鉴定重组质粒,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果构建了pQE30-Ag85C重组质粒;在大肠杆菌中表达了一分子量约30kDa的重组蛋白。结论重组质粒pQE30-Ag85C构建成功并在大肠杆菌中高效表达,为Ag85C保护性抗原位点分析和新型疫苗的研制奠定了基础。     

人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达

目的　克隆人细小病毒B19　VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达。方法　利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定。结果　扩增出一条约 801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致。经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为 54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1。薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的 27. 4%。结论　获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

猪链球菌2型gdh基因的克隆与表达

目的 克隆表达猪链球菌2型诊断性抗原谷氨酸脱氢酶GDH. 方法 根据基因库中的gdh基因序列设计PCR引物,自病人分离株2007SF0165基因组扩增GDH的编码基因gdh,克隆至pMD19-T载体后进行测序分析,并且构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测. 结果 PCR法自猪链球菌2型菌株2007SF0165基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族Ⅰ的典型保守序列;构建筛选的原核重组表达质粒pGEX4T-2-gdh经诱导表达,获得蛋白相对分子质量为45 kDa目的蛋白. 结论 克隆并表达出猪链球菌2型诊断性抗原GDH,可为进一步研究奠定坚实的基础.     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原基因在大肠杆菌中的表达

采用 PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株 (PFD- 3/ YN)丝氨酸重复抗原基因片段 ,经基因序列测定后克隆于 p GEX- 4T- 1融合蛋白表达载体 ,并转化大肠杆菌 TG1。SERA基因与 p GEX- 4T- 1重组后能在大肠杆菌 TG1中表达一 45 KDa的融合蛋白 ,当工程菌 OD5 90 为 0 .8～ 1.0时 ,加入终浓度 1m mol/ L IPTG进行诱导 ,表达量较高。采用 dot- EL ISA对表达产物进行鉴定。结果表明 SERA融合蛋白能被抗 SERA单克隆抗体所识别。     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT-0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测

目的构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)CPSIT-0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT-0531基因,并构建pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT-0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT-0531蛋白的免疫原性。结果成功构建了pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT-0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000。结论成功克隆表达了His-CPSIT-0531,该蛋白具有较好的免疫原性。     

旋毛虫表皮胶原蛋白基因的原核表达

目的构建表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,诱导其表达胶原蛋白。方法应用PCR技术扩增目的基因X21,纯化后将其克隆入表达载体pET28a,重组质粒经酶切鉴定后,转入大肠杆菌DE3诱导表达,利用SDS-PAGE检测胶原蛋白的表达效果。结果利用DNA重组技术构建了表皮胶原蛋白基因X21的原核表达载体pET28-X21ex,转化大肠杆菌后经诱导表达了30kDa的融合蛋白,以诱导3h的表达量最高,在35%以上。结论旋毛虫表皮胶原蛋白基因X21在大肠杆菌中能够高效表达,为进一步研究旋毛虫表皮胶原蛋白的结构与功能奠定了基础。