大肠杆菌致U937细胞凋亡的研究

目的 探讨大肠杆菌感染对人U937细胞凋亡的诱导作用。方法 以细胞形态学观察及Annexin V／PI双染流式细胞仪检测分析大肠杆菌感染U937细胞后，不同作用时间U937细胞的凋亡情况。结果 Hoechst 33258染色荧光显微镜下观察：大肠杆菌感染20min及30min后偶见细胞凋亡，感染60min及90min时可见许多细胞有典型的凋亡形态学改变，并可见凋亡小体；AnnexinV／PI双染可见U937细胞凋亡百分率随大肠杆菌感染时间延长而增高。感染60min及90min时，细胞凋亡率与其它组相比明显增高，差异有显著性（P〈0．001）。结论 大肠杆菌以时间依赖方式诱导人类U937细胞凋亡。     

急性胃肠炎时菌毛的电镜观察

目的：通过透射电镜及扫描电镜观察大肠埃希菌引起的急性胃肠炎时细菌特殊结构,了解菌毛粘附与致病的关系。方法：以临床腹泻患儿新分离的大肠埃希菌为材料,制备扫描电镜及透射电镜标本,对照组为健康同龄儿童粪便。结果：新分离的腹泻患者大肠埃希菌普通菌毛遍布菌体,性菌毛呈中空管状,多处分枝,性菌毛呈多重接合。结论：腹泻患儿与健康同龄儿童组比较普通菌毛多,性菌毛为分枝状,可见多重接合。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达

OBJECTIVE: To investigate the structure and function of human nerve growth factor (beta-NGF) and the gene encoding beta-NGF. METHODS: A pair of specific primers (29 mer) for the sequence encoding human beta-NGF was designed and synthesized. A 380 bp fragment was amplified from human blood genomic DNA by polymerase chain reaction, and cloned into pGEM-T Easy vector. The identified insert fragment from the recombinant pGEM-T-NGF was directionally ligated with linearized pGEX-5T with the compatible termini. E. coli JM 109 was transformed with the expression recombinant p5TNGF and induced by IPTG. RESULTS: The cloned DNA fragment was identified as the full-length sequence encoding human beta-NGF by restriction analysis and DNA sequencing. SDS-PAGE and Western blot revealed the cloned NGF gene expressed as a fusion protein (40.5 x 10(3) u) in the cells transformed by p5TNGF. The soluble fusion protein was determined to be 503.2 mg/L, accounting for 6.8% of the total soluble protein (7.4 g/L) of bacterial cells. This fusion protein was found to have antigenic activities of NGF. CONCLUSION: The clone containing the full-length sequence encoding human beta-NGF is obtained and successfully expressed in E. coli to be of use for studying the biological functions of human beta-NGF gene.     

亚甲蓝光化学效应对血液中大肠杆菌灭活效果研究

目的　筛选亚甲蓝 (MB)光化学效应对血液中大肠杆菌的最佳灭活条件。方法　通过正交试验、单因素及双因素作用灭活细菌效果测定。筛选亚甲蓝光化学效应灭活血液中大肠杆菌的最佳条件及影响因素 ,观察其灭活效果。结果　正交实验显示 ,亚甲蓝光化学效应对血液中细菌灭活作用受 MB含量、卤钨灯照射强度和照射时间等因素的影响。试验筛选的最佳处理条件可以使大肠杆菌下降近 5个对数级。亚甲蓝与卤钨灯照射两因素的 T/ E值大于 1,具有协同增效作用。结论　亚甲蓝光化学效应灭活血液中大肠杆菌的最佳条件是 15μmol/ L亚甲蓝 ,4 0 0 0 0 L ux卤钨灯照射强度 ,4 0 min作用时间 ,0 .35 mmol/ L芸香苷     

人lrp-cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pcTAT后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6His-TAT-LRG融合蛋白表达.结果:测序结果表明,获得了全长人lrp-cDNA全长编码区,其序列与GenBank已经公布的不完全一致;SDS-PAGE分析表明,6His-TAT-Lrp融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达量约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生阳性反应.结论:得到人lrp-cDNA全长编码区序列,并成功表达,为人lrp功能的深入研究奠定了基础.     

Characterization of cefoperazone resistance gene on plasmid pFC in E. coli HX88108]

OBJECTIVE: To investigate the characterization of cefoperazone resistance gene (CPZr) on plasmid pFC in E. coli HX88108 and inquire into the mechanism of resistance to CPZ at the molecular level. METHODS: E. coli HX88108 strain which demonstrated high-level resistance to cefoperazone (MIC, > 512 micrograms/ml) was isolated from a severely infected patient in 1988. Five plasmids coexisting in the strain were designated pFC, pFT1; pFT2, pFT3 and pFX, respectively. Four plasmids except pFX conferred CPZ resistance. Cefoperazone resistance gene (CPZr) has been cloned from plasmid pFC. beta-lactamase assays with Nitrocefin were performed. RESULTS: The expression product of CPZr was beta-lactamase. The high level beta-lactamase enzymatic activities against cephaloridine of CPZr transformants which were detected spectrophotometrically at 260 nm wave length demonstrated high level similarities to that of pFC. MICs of 18 antibiotics were determined according to a guideline of NCCLS by broth dilution method. CPZr transformants showed moderate level resistance to ampicillin, cefazolin, cefazolin, cefamandole and CPZ (MIC, 64 micrograms/ml). Meanwhile, susceptibility testing results demonstrated that the level of resistance to CPZ of pFC transformant in this study (MIC, 64 micrograms/ml) was much lower than that in 1988 (MIC, > 512 micrograms/ml) and resistance to nofloxacin and aminoglycosides was not observed. Induction experiment and temperature-sensitive mutation of CPZ resistance were performed. CPZr colonal strains revealed the higher-level of resistance to CPZ (MIC, 512 micrograms/ml) due to antibiotic CPZ induction rather than temperature sensitive mutation. CONCLUSION: This observation suggests that resistance to antibiotics encoded by plasmid might have been lower or lost under no antibiotic stress in a certain period, but higher under heavy stress.     

死后不同时间大鼠肌肉的扫描电镜观察

为提示尸僵过程中肌肉的形态变化，作扫描电镜对死后不同时间取材的４０只大鼠肌肉进行了观察，并同时作磷钨酸苏木素染色。洮镜观察结果显示，大鼠肌纤维横纹在死后４小时内模糊，６￣２４小时反而清晰。扫描电镜结果显示，尸僵形成过程中确定实发生了肌肉收缩，因为Ｚ线间距变短，Ⅰ带变窄。尸僵形成的基本生化过程与肌肉收缩是一致的，不同的是前者发生在死后，后者发生在生前。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA．并构建成pBV220-survivin原核表达质粒，将其导入Ecoli Bl21(Gold)中，诱导表达survivin蛋白。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Western blotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致，表达质粒在E-coli Bl21(Gold)中得到高效表达，表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白，其纯度达到95％以上。Western blotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白。为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因，并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因，与TA载体连接后进行核酸序列测定．并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220，在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因，其cDNA序列与献报道的一致，构建了重组质粒pBV220-OB，并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用，以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

自杀基因ePNP诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究

目的 通过制作ePNP转基因小鼠,研究自杀基因ePNP对小鼠巨噬细胞凋亡的影响。方法 实验分ePNP转基因小鼠组和野生型小鼠组,在体外培养的各组小鼠腹腔巨噬细胞中分别加入浓度为0、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml的前体药物氟达拉滨（fludarabine）,采用活细胞计数试剂盒（CCK-8）检测腹腔巨噬细胞加药后的细胞存活率;其次,给ePNP转基因小鼠和野生型小鼠腹腔注射剂量分别为0、10、20、60mg/kg的fludarabine,分别采用流式细胞术和原位凋亡检测试剂盒（TUNEL法）检测加入fludarabine后腹腔巨噬细胞和组织（肺、脾）巨噬细胞的凋亡情况。结果 CCK-8检测显示给药后ePNP小鼠腹腔巨噬细胞存活率明显下降,尤其在浓度为2.0μg/ml,细胞存活率仅为10.8%±0.8%;其次,流式细胞术和TUNEL结果也显示给药后其腹腔巨噬细胞和肺、脾巨噬细胞凋亡明显增加,并且存在剂量效应关系。CCK-8、流式细胞术和TUNEL法均显示野生型小鼠给药后没有明显巨噬细胞凋亡。结论 自杀基因ePNP能在前体药物fludarabine协同作用下,诱导小鼠巨噬细胞凋亡。     

氧化苦参碱对大肠埃希菌的体外药敏试验

目的：：观察氧化苦参碱对大肠埃希菌标准株的体外药敏情况。方法：采用二倍稀释法,用0.9%氯化钠注射液将苦参碱胶囊分别稀释为8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5 mg/L的药液,按药液：MH琼脂=1：9的比例分别配制含药培养基,每个浓度各3个,并设空白和0.9%氯化钠注射液组为对照。大肠埃希菌复苏后,配制菌液备用,接种环取菌液一环接种于各培养基内,置36℃的培养箱内,培养24 h,观察结果。结果：各个含药培养基大肠埃希菌生长良好,与对照组相比无明显差异。结论：氧化苦参碱对大肠埃希菌的生长无影响。     

抗肿瘤坏死因子单克隆抗体对细菌感染小鼠的治疗效果

z肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是具有广泛生物学活性的多肽细胞因子，低水平时参与机体的免疫防御，高水平时会给机体造成严重损害，在感染性疾病的发生、组织损伤、炎症、致死性休克等许多方面起重要介质作用。本研究试图通过用抗一TNF单抗中和因细菌感染而过多产生的TNF来降低机体内TNF水平，以观察抗一TNF单抗的治疗效果。材料和方法一、实验材料昆明小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，大肠杆菌由本院细菌室提供，抗-TNF单克隆抗体及TNFELISA检测试剂盒（可测到10pg／ml的低限）均为自产。二、实验方法1．…     

血链球菌丙酮酸氧化酶基因表达克隆的构建与鉴定

目的 构建血链球菌丙酮酸氧化酶基因Sopox的表达质粒,为研究丙酮酸氧化酶基因Sopox表达的调节奠定基础。方法 将从血链球菌ATCC10557克隆的丙酮酸氧化酶基因Soopox重组到pBV220,表达载体,并转化入大肠杆菌E.coliJM105,观察Sopox基因在大肠杆菌中的表达。结果 通过酶切后电泳鉴定,Sopox基因重组入pBV220并转化入E.coliJM105;经42℃yte nf rg ,SDS-PAGE显示pBV220/Sopox/JM105表达分子量约为65kd的蛋白,与根据Sopox基因DNA序列预测的蛋白分子量一致;pBV220/Sopox/JM105的蛋白表达在42℃诱导4小时后达高峰。结论 丙酮酸氧化酶基因Sopox已被成功地克隆到pBV220/Sopox/JM105的蛋白表达在42℃诱导4小时后达高峰。结论 丙酮酸氧化酶基因Sopox已被成功地克隆到pBV220,并在E.coliJM105中表达。     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ＰＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因，快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＥＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＥＣ物理图谱上３．２ｋｂ至４．８ｋｂ区间内，其分隔量约１．６ｋｂ。