蛋白激酶C活性调节剂对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞的作用及意义

目的研究蛋白激酶C（PKC）激活剂PMA和抑制剂GF109203X对豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞生长状态及PKC蛋白表达的影响。方法眼罩遮盖诱导近视模型,酶消化法培养其视网膜Mailer细胞,并鉴定。PMA、GF109203X分别干预近视眼Mailer细胞。MTT测细胞活力,TUNEL染色检测凋亡细胞,Westren blotting测PKC蛋白表达。结果95％以上的培养细胞阳性表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（Vimentin）。近视组PKC蛋白表达较正常组上调（P〈0．05）。PMA、GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞的抑制率升高和诱导其凋亡（P〈0．05）。PMA诱导近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达进一步上调,100nmol／L组和1000nmol／L组表达量高于10nmol／L组（P〈0．05）。1μmol／L和10μmol／L GF109203X均能引起近视眼Mailer细胞PKC蛋白表达下调,10μmol／L的抑制作用大于1μmol／L（P〈0．05）。结论PKC蛋白在豚鼠近视眼视网膜Mailer细胞表达升高,且其表达受PMA和GF109203X调控。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的 研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化.方法 3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型(以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照),剩余的20只豚鼠作正常对照.用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞.RT-PCR检测酪氧酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、诱导型一氧化氙合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、神经型一氧化氮合成酶(neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、视黄醛脱氢酶(retinaldehyde dehydrogenase,RALDH)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fi-broblast growth factor,bFGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.数据分析采用One-way ANOVA检验.结果 眼罩遮盖10 d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-B mRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-B mRNA上调(P<0.05),TH mRNA下调(P<0.05).iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达.三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDH mRNA.结论 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-B mRNA上调,TH mRNA下调.Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮(nitric oxide,NO)、多巴胺(dopamine,DA)、bFGF和TGF-β的一个重要来源.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。方法3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型（以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照）,剩余的20只豚鼠作正常对照。用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞。RT-PCR检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase,iNOS）、神经型一氧化氮合成酶（neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase,RALDH）、醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase,ALDH）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fi-broblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β（transforminggrowth factor-β,TGF-β）的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况。数据分析采用One-way ANOVA检验。结果眼罩遮盖10d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-βmRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调（P〈0.05）,TH mRNA下调（P〈0.05）。iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达。三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDHmRNA。结论豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调,TH mRNA下调。Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮（nitric oxide,NO）、多巴胺（dopamine,DA）、bFGF和TGF-β的一个重要来源。     

PKC对豚鼠近视眼视网膜M&#252;iler细胞近视因子基因的调控作用

目的研究蛋白激酶C（PKC）对豚鼠近视眼视网膜Mtiller细胞中酪氨酸羟化酶（TH）、诱导型NO合成酶（iNOS）、神经型NO合成酶（nNOS）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子B（TGFl3）基因表达的调控作用。方法眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,酶消化法原代培养其视网膜M&#252;ller细胞,GFAP免疫组织化学染色进行细胞鉴定。根据干预因素不同,把M&#252;ler细胞分为正常对照组、近视组、近视＋GF109203X组、近视＋PMA组和近视＋DMSO组。RT—PCR检测TH、iNOS、nNOS、bFGF和TGFβmRNA的表达情况。结果与正常对照组比较,近视眼视网膜Mtiller细胞iNOS、nNOS、bFGF和TGFβmRNA表达上调,THmRNA表达下调（P〈0．05）。PKC激活剂（PMA）激活PKC后,近视眼视网膜M&#252;ller细胞表达nNOS、iNOS、TH和bFGFmRNA上调（P〈0．05）;GF109203X抑制PKC活性后,这些因子的mRNA表达下调（P〈n05）。结论豚鼠近视眼视网膜M&#252;ller细胞nNOS、iNOS、bFGF和TH基因的表达受PKC调控,M&#252;ller细胞可能为近视信号因子的一个重要来源。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的 研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化.方法 3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型(以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照),剩余的20只豚鼠作正常对照.用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞.RT-PCR检测酪氧酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、诱导型一氧化氙合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、神经型一氧化氮合成酶(neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、视黄醛脱氢酶(retinaldehyde dehydrogenase,RALDH)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fi-broblast growth factor,bFGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.数据分析采用One-way ANOVA检验.结果 眼罩遮盖10 d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-B mRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-B mRNA上调(P<0.05),TH mRNA下调(P<0.05).iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达.三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDH mRNA.结论 豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-B mRNA上调,TH mRNA下调.Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮(nitric oxide,NO)、多巴胺(dopamine,DA)、bFGF和TGF-β的一个重要来源.     

兔视网膜Mller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长,72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95%以上。电镜观察显示:细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化。     

大鼠视网膜Mller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性

目的:研究并验证成年哺乳动物视网膜中Mller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法:对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液(含NMDA,kainate,FGF2和insulin)刺激Mller细胞,左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Mller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Mller细胞纯度,通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Mller细胞上的表达。结果:流式细胞分析结果显示,本实验分离培养的原代Mller细胞纯度可达96%以上;细胞免疫荧光组织化学显示激活后Mller细胞能表达nestin,流式细胞技术证明,激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论:成年大鼠视网膜Mller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。     

视网膜Müller细胞调控豚鼠形觉剥夺性近视形成的研究

目的 研究视网膜Müller细胞在豚鼠形觉剥夺性近视形成中的作用.方法 眼罩遮盖建立豚鼠形觉剥夺性近视眼模型,分为正常对照组、DL-α-氨基己二酸(DL-α-AAA)组、生理盐水组、遮盖组、遮盖+DL-α-AAA组、遮盖+生理盐水组.DL-α-AAA组和遮盖+DL-α-AAA组右眼玻璃体内注射8 μg DL-α-AAA.14 d后检影验光测屈光度,A型超声测眼轴长度,免疫组织化学、Western blotting检测视网膜中Vimentin的表达,TUNEL染色检测凋亡细胞.结果 眼罩遮盖14 d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.Vimentin蛋白阳性表达于视网膜Müller细胞.DL-α-AAA组右眼远视度数高于正常对照组,但视网膜Vimentin蛋白表达量下调(P＜0.05).DL-α-AAA引起遮盖眼近视度数减轻、视网膜Vimentin蛋白表达量下调(P＜0.05).各实验组的视网膜均未发现凋亡细胞.结论 玻璃体内注射DL-α-AAA能特异性作用于视网膜Müller细胞,有效抑制豚鼠眼球正视化和近视形成.     

金纳多对高糖所致视网膜Mller细胞合成谷胱甘肽减少的保护作用

目的研究高浓度葡萄糖对体外培养兔视网膜Mller细胞合成谷胱甘肽(GSH)的影响及自由基清除剂金纳多(EGb761)的作用。方法采用比色法测定不同浓度葡萄糖(5.5、30、40、50mmol/L)下,兔Mller细胞合成GSH的质量分数。在50mmol/L葡萄糖培养液中加入不同质量浓度EGb761(0、5、10、15、20、25、30、45、90μg/mL)培养3d后测定兔视网膜Mller合成GSH的质量分数。结果各浓度葡萄糖均使兔视网膜Mller细胞合成GSH的质量分数减少。加入各质量浓度EGb761后GSH合成增加,质量浓度为10μg/mL时增加最高。结论EGb761对高浓度葡萄糖致兔视网膜Mller细胞合成GSH质量分数减少起保护作用。     

豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜Müller细胞中bFGF的表达

目的 观察视网膜Müller细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)中的表达,进一步探讨近视眼的发病机制.方法 用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠FDM模型;采用玻璃体腔注射L-α-氨基己二酸(L-α-AAA)破坏视网膜Müller细胞,观察其对豚鼠FDM形成的影响.视网膜检影验光测屈光度,A型超声测量眼轴长度.免疫组织化学法观察bFGF在视网膜Müller细胞中的表达.结果 遮盖眼与对照眼相比,产生了相对性近视(P＜0.05),眼轴增长(P＜0.05);去遮盖后,近视度数降低(P＜0.05);破坏视网膜Müller细胞后,近视度数较单纯遮盖眼降低(P＜0.05).近视眼与对照眼相比,视网膜Müller细胞中bFGF表达减弱.结论 视网膜Müller细胞可能参与了FDM形成的调控;视网膜Müller细胞中bFGF的表达可能与FDM有关.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

PKC活化对兔视网膜色素上皮(RPE)细胞Nrf2表达的影响

目的 研究蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活化后是否能引起体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞内核因子E2相关因子2(nuclear factor enthroid 2-related factor 2.Nrf2)的激活和核转位,探讨PKC活化是否对RPE细胞内的Nrf2表达产生影响.方法 将一定浓度的PKC特异激活剂佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)作用在体外培养的兔RPE细胞(B组)以及Nrf2抑制剂预处理后的RPE细胞(C组),再培养24 h后,应用免疫荧光技术及Western blot测量Nrf2在胞核内的表达情况,并与空白对照(A)组进行对比分析.结果 免疫荧光检测RPE细胞核内的Nrf2蛋白表达结果显示:与A组相比,B、C组RPE细胞核中Nrl2蛋白表达均增加,其中B组增加显著,C组较B组增加幅度低;3组之间差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测RPE细胞核内的Nrf2蛋白经图像分析处理定量,扫描灰度值差异显著(A组0.286±0.013,B组1.304±0.033,C组0.671±0.087;P＜0.05).结论 PKC激活后可使兔RPE细胞浆中Nrf2发生核转位,Nrf2抑制剂能减弱PKC的作用.     

蛋白激酶C在缺氧人RPE细胞表达血管内皮生长因子中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在缺氧诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用。方法在细胞培养液内加入CoCl2溶液以模拟缺氧环境,培养RPE细胞0·5、48h后,用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将PKC激动剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液,在缺氧状态下分别培养6、12、24h后,用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。对照组为常氧状态下培养的RPE细胞。结果免疫荧光染色显示缺氧及常氧状态下,RPE细胞浆及胞核内均有PKC的表达。PKC激动剂PMA可增强缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达,而PKC抑制剂Chelerythrine可减弱缺氧状态下RPE细胞对VEGF的表达。结论缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。     

先天性白内障近视发生的危险因素分析

目的：探讨先天性白内障近视发生的危险因素,提供预防近视的科学依据。方法：对83例109只先天性白内障眼球的各屈光因子进行生物学测量,确定其屈光状态,并用Logistic回归的方法进行单因素和多因素分析。结果：先天性白内障的近视发和生率是61.27%,眼轴长度为近视发生的主要危险因素,OR＝138.699。结论：尽早去除先天性白内障所造成的形觉剥夺,保持或恢复视觉发育敏感期正常的视觉环境,有利于预防近视的发生。     

Impairment of retinal adaptive circuitry in the myopic eye

Previous studies have proposed that the inner retina is affected in myopes. This study aimed to investigate the changes in adaptive circuitry of the inner retina in myopia, using the global flash multifocal electroretinogram (global flash mfERG) with different levels of contrast (luminance modulation). Fifty-four myopes had global flash mfERG recorded with different contrasts. The direct component (DC) and the induced component (IC) of the mfERG response were pooled into six regions for analysis. The response amplitudes and implicit times at different contrasts were also analysed. Results showed that myopes had significant reduction in the paracentral DC amplitude for the 29% and 49% contrasts and in the paracentral IC amplitude at all contrasts measured. The peripheral IC amplitude for the 49% contrast was also reduced. No significant change was found in implicit time for either DC or IC response. Refractive error explained about 14% of the variance in DC and 16% of the variance in IC amplitude respectively; axial length could not account for additional variance in either paracentral DC or IC amplitudes in the hierarchical regression models used. We concluded that the paracentral retinal region in myopes showed signs of impaired retinal adaptation, suggesting a functional loss at the inner retinal layer. In addition, functions attributed to the outer retinal layer showed only small changes due to myopia.     

抗增生药物对人视网膜神经胶质细胞的抑制作用

目的寻找抑制视网膜、玻璃体内细胞增生的有效药物;明确抗增生药物秋水仙碱、道诺霉素和５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）对体外培养的人视网膜胶质（ｒｅｔｉｎａｌ ｇｌｉａ,ＲＧ）细胞的作用。方法用 ＭＴＴ法测定秋水仙碱（０．５～１６．０μｇ／ｍｌ）、道诺霉素（０．１～３．２μｇ／ｍｌ）和５－Ｆｕ（０．５～１６．０μｇ／ｍｌ）对体外培养人ＲＧ细胞的作用。结果秋水仙碱（１．０～１６．０μｇ／ｍｌ）、道诺霉素（０．２～３．２０μｇ／ｍｌ）和 ５－Ｆｕ（１．０～１６．０μｇ／ｍｌ）３组药物对培养细胞均有抑制作用,与对照组均差别显著（Ｐ＜０．０１）,ＩＤ_（５０）分别为３．１１μｇ／ｍｌ,０．７９μｇ／ｍｌ和５．２３μｇ／ｍｌ。结论秋水仙碱、道诺霉素和５－Ｆｕ对ＲＧ细胞有明显抑制作用。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中TGFβ2、VIP、DA的表达

目的 研究转化生长因子β2(TGFβ2)、血管活性肠肽(VIP)和多巴胺(DA)在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的变化.方法 眼罩遮盖诱导豚鼠近视眼,酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞,GFAP、Vimentin免疫组织化学染色进行细胞鉴定.Westren blotting检测TGFβ2、VIP、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.高效液相色谱-电化学法测定视网膜Müller细胞分泌DA的质量浓度变化.结果 眼罩遮盖14d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出豚鼠视网膜Müller细胞,95%以上的培养细胞阳性表达GFAP和Vimentin.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达TGFβ2、VIP、TH蛋白,遮盖眼表达TGFβ2和VIP蛋白上调(P＜0.05)、TH蛋白下调(P＜0.05).与正常对照眼、自身对照眼比较,遮盖眼视网膜Müller细分泌DA减少.结论 Müller细胞是视网膜近视信号因子TGFβ2、VIP和DA的一个重要来源.在近视发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子,参与近视发生的调控.     

生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响

目的　探讨生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响。方法　将ARPE-19细胞分为对照组（不作任何处理）,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1、50 nmol?L^-1 YM155组（用相应浓度YM155处理细胞24 h）,MTT检测各组细胞活力,Western blot检测各组细胞表皮生长因子受体（EGFR）、AKT、Survivin蛋白的表达情况;采用细胞迁徙实验和免疫荧光染色实验检测对照组与20 nmol?L^-1 YM155组细胞迁徙能力和EGFR表达情况。结果　MTT检测结果显示,与对照组相比,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1和50 nmol?L^-1YM155组ARPE-19细胞的相对细胞活力平均降低约42.3%、55.6%、73.0%,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。使用20 nmol?L^-1YM155处理ARPE-19细胞24 h会降低细胞迁徙能力。YM155处理细胞24 h后,10 nmol?L^-1 YM155组细胞EGFR和AKT蛋白表达,与对照组相比无明显差异（均为P<0.05）,但Survivin蛋白表达下调（P<0.05）;20 nmol?L^-1YM155组细胞AKT蛋白表达,与对照组相比亦无明显差异（P>0.05）,EGFR和Survivin蛋白表达均下调（均为P<0.05）;50 nmol?L^-1组细胞EGFR、AKT和Survivin三种蛋白表达均下调,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示,对照组ARPE-19细胞EGFR均匀表达于细胞膜,20 nmol?L^-1YM155组表达于细胞膜的EGFR被内吞转移到细胞质内,在细胞核周围呈颗粒状分布;YM155可以诱导细胞骨架损害、F-肌动蛋白纤维排列紊乱,细胞核增大。结论　YM155能抑制ARPE-19细胞活力和迁徙能力,YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响与Survivin、EGFR和AKT的蛋白表达下调有关。