靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

RNA干扰技术沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

 目的:研究细胞分裂周期素25a（cell division cycle 25a,CDC25a）基因沉默后对于人肝癌细胞系HepG2增殖的影响。同时探讨该影响发生的可能作用机制。 方法: 使用RNA干扰技术沉默人肝癌HepG2细胞的CDC25a基因,采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞中的CDC25a 及其作用基因cyclin E及CDK2的 mRNA表达水平,Western blotting检测CDC25a的蛋白表达水平,并采用MTT法、Giemsa染色法及流式细胞技术检测细胞的增殖情况。 结果: CDC25a 的mRNA及蛋白表达水平在RNA沉默组细胞中的表达低于阴性对照组及正常对照组细胞（P＜0.05）。Cyclin E及CDK2 的mRNA表达水平在沉默组低于阴性对照及正常对照组（P＜0.05）。MTT法、Giemsa染色法结果显示沉默组细胞增殖能力低于阴性对照组及正常对照组细胞（P＜0.05）,流式细胞技术结果显示沉默组细胞阻滞在G1期。 结论: LV-CDC25a-RNAi重组体感染HepG2细胞可以有效抑制CDC25a基因的表达,使人肝癌HepG2细胞增殖受到抑制,提示CDC25a基因可能是肝癌治疗的关键靶点。     

Manumycin inhibits cell proliferation and the Ras signal transduction pathway in human hepatocellular carcinoma cells

Manumycin was reported to have inhibitory effect on farnesyltransferase by competing with the farnesyl pyrophosphate substrate. It exhibited different antiproliferative activity in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, primary cultured human cardiac muscle cells and human liver cells (CLC). HepG2 cells overexpressing ras gene were more sensitive to manumycin than the other cells. The difference might be related to Ras protein levels in these cell lines. Manumycin reduced the amount of functional ras localized at the cytoplasmic membrane, resulting in blocked C-raf-1 assocation with Ras. Manumycin inhibited ERK1/2 phosphorylation in HepG2 cells without reduced expression of ERK1/2 protein. The levels of protein MKP-1 were significantly up-regulated. Our study also demonstrated that manumycin inhibited p85/PI3K and Akt phosphorylation without reduced expression of p85/PI3K and Akt, and interfered with the association of p85/PI3K and Ras. These findings indicated that manumycin interfered with Ras membrane localization, shut down the downstream pathways of Ras and inhibited cell proliferation in HepG2 cells.     

hIL-2分泌肽序列在HepG2细胞中对hEndostatin表达和分泌差异的影响

目的:了解分泌肽序列在HepG2细胞中对人内皮抑素基因(hEndostatin)的cDNA表达和分泌差异的影响。方法:构建不含hIL-2分泌肽序列的真核表达载体pBlast-hEndo质粒, 转染人的HepG2细胞株, 用RT-PCR的方法检测HepG2(pBlast-hIL2-hEndo), HepG2(pBlast-hEndo), HepG2(pBlast-Mcs)和HepG2中hEndostatin的mRNA表达水平, 及制备4种细胞的总蛋白和收集各自的培养上清, 进行Westernblot分析蛋白表达和分泌的差异。结果:发现HepG2(pBlast-hIL2-hEndo)中hEndostatin的mRNA的水平显著高于HepG2(pBlast-hEndo)。而仅在HepG2(pBlast-hIL-2-hEndo)的细胞总蛋白和上清, 及HepG2(pBlast-hEndo)的细胞总蛋白中检测到hEndostatin表达, 在其它各株细胞总蛋白及上清中, 未检测到hEndostatin。结论:hIL-2分泌肽序列能促进hEndostatin基因在HepG2细胞中表达及分泌。     

凋亡素诱导HepG2细胞凋亡过程中Mcl-1 mRNA和蛋白水平的变化及意义

目的: 探讨凋亡素诱导肝癌细胞HepG2凋亡过程中Mcl-1 mRNA和蛋白水平的变化及其意义。方法: 经脂质体介导将pCDNA3.0-VP3转入HepG2细胞内,48 h后采用Western blotting检测凋亡素、Mcl-1和细胞色素C,实时定量RT-PCR检测细胞内的Mcl-1 mRNA。结果: VP3基因成功地转入HepG2细胞内并稳定表达凋亡素。与空白对照相比,表达凋亡素的细胞出现Mcl-1 mRNA含量减少(0.09%±0.00% vs 0.41%±0.14%, P<0.05),细胞内Mcl-1水平下降(0.43%±0.01% vs 0.90%±0.04%, P<0.01),线粒体释放细胞色素C增加(0.98%±0.02% vs 0.62%±0.03%, P<0.01)。结论: 凋亡素诱导HepG2细胞凋亡过程中存在细胞内Mcl-1 mRNA和蛋白水平的下降,以及线粒体细胞色素C的释放增加。凋亡素诱导的细胞凋亡可能与其下调细胞内Mcl-1 mRNA与蛋白水平有关。     

ISGF3:IFN-α抗乙型肝炎病毒信号转导机制的重要因子

目的　研究干扰素 α(IFN α)抗乙型肝炎病毒(HBV)的信号转导机制。方法　用定量聚合酶链反应(PCR)检测IFNα2b处理前、后的HepG2 2 15细胞上清的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)水平。半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测IFNα2b处理后不同时点的HepG2 2 15细胞和其母源细胞HepG2 细胞内信号转导和转录活化因子1(STAT1)、STAT2、干扰素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、2′5′寡腺苷酸合成酶(2′5′OAS)、RAN依赖蛋白激酶(PKR)的mRNA表达水平。WesternBlot检测ISGF3γ的蛋白质表达水平。并用染料木黄酮阻断IFNα2b信号转导后再次检测上述指标。结果　IFNα2b处理8h后,HepG2 2 15细胞上清HBVDNA平均减少0 72log 10copies ml,而加染料木黄酮后则无减少。IFNα2b处理后,HepG2 和HepG2 2 15细胞中STAT1、STAT2、ISGF3γ、2′5′OAS和PKRmRNA水平明显升高;加染料木黄酮后前3个因子mRNA水平仍然能检测到,而2′5′OAS和PKRmRNA则受到抑制。WesternBlot检测也提示IFNα2b处理后ISGF3γ蛋白质水平升高,加染料木黄酮后其表达受到抑制。结论　Janus酪氨酸激酶(JAK) STAT途径在IFN α抗HBV中发挥主要作用,而ISGF3是该途径的一个重要因子。     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT-PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA-APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1.3倍HBV载体pHBV1.3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

紫杉醇诱导HepG2肝癌细胞凋亡中miR-224沉默凋亡抑制因子5基因的作用

目的 探讨紫杉醇诱导肝癌HepG2 细胞凋亡时miRNA对基因的沉默的作用。 方法 用不同浓度紫杉醇处理肝癌HepG2细胞后,流式细胞术检测其细胞凋亡;通过实时定量PCR(Real-time PCR)测定miR-224和凋亡抑制因子5（api-5） mRNA的表达;用免疫组织化学二步法和免疫印迹法(Western blotting)检测API-5蛋白的表达。 结果 紫杉醇诱导HepG2细胞凋亡时,通过2^-ΔΔCT法分析发现,除了0.5mg/L、1mg/L紫杉醇培养HepG2肝癌细胞24h miR-224不升反降外,其他浓度和处理时间miR-224表达均显示上调;0.5mg/L、1mg/L紫杉醇培养HepG2肝癌细胞24h api-5 mRNA表达稍微降低,0.5mg/L紫杉醇处理48h无增长,其他浓度和处理时间api-5 mRNA表达均上调;应用IPP v 5.1图像分析软件处理,经 t 检验分析发现,紫杉醇处理后API-5蛋白表达均下调（P<0.05）。 结论 上调的miR-224可能作用其靶基因api-5的表达,通过与api-5 mRNA的3’UTR结合阻止翻译的完成,从而对肝癌细胞的凋亡途径产生影响。     

From an inborn error patient to a search for regulatory meaning: a biotin conducted voyage

This article summarizes some findings of a research that I have pursued for the past 25 years, whose roots are immersed in the field of inherited metabolic disorders, and deal with different aspects of the vitamin biotin, starting with a patient with multiple carboxylase deficiency (MCD). Several of MCD clinical manifestations resemble those of infant malnutrition; we demonstrated that about one-third of infants with this common nutritional disorder were indeed biotin-deficient, and that this deficiency is metabolically significant, by studying urine instead of blood, studying urinary organic acids by gas chromatography-mass spectrometry. Remarkably, the metabolic abnormalities became apparent only after protein feeding was started, suggesting that this phenomenon may contribute to the worsening of malnourished individuals when they are abruptly fed. Afterwards, we studied biotin deficiency at the tissue level. Carboxylase activities and masses were significantly reduced in liver, kidney, muscle, adipose tissue, intestine, and spleen, but brain and heart were spared; their mRNAs remained unchanged. On the other hand, holocarboxylase synthetase (HCS) mRNA levels were markedly low in the deficient animals, and increased upon biotin injection. Over 2000 human genes have been identified that depend on biotin for expression. To probe into the "logic" of this enigma, we have started comparative studies among evolutionarily distant organisms, such as mouse and Saccharomyces cerevisiae, and we are now looking for biotin effects on specific genes and proteins, such as HCS and hexokinases, and on their proteomes.     

乙型肝炎病毒在体内外抑制补体C3和C4表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对补体C3和C4表达的影响,并探讨其调节机制.方法 采用基因芯片筛选HepG2和HepG2.2.15细胞的差异表达基因,免疫比浊法检测HBV患者和健康对照者补体C3和C4血清学水平,将HBV感染性克隆pHBV1.3转染HepG2细胞,RT-PCR和Western blot法检测C3和C4表达水平的变化.结果 补体C3和C4 mRNA在HepG2.2.15细胞中水平降低;C3和C4在慢性乙型肝炎患者和肝癌患者的血清学水平明显低于健康对照者(P＜0.05);HBV能够在mRNA和蛋白水平下调C3和C4的表达.结论 HBV能够在体内外抑制补体C3和C4的表达.     

乙醇刺激HepG2细胞分泌VASN蛋白的生物学功能研究

目的：探究乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响,及其对HUVEC细胞迁移的影响。方法乙醇刺激HepG2细胞,定量PCR （ qPCR）检测HepG2细胞VASN mRNA水平的变化, Western印迹检测HepG2细胞与细胞上清中VASN蛋白水平的变化。划痕愈合实验检测细胞共培养条件下,乙醇刺激的HepG2细胞培养上清对HUVEC细胞迁移的影响。结果 qPCR结果显示,乙醇可上调HepG2细胞VASN mRNA水平。 Western印迹结果显示,细胞VASN蛋白表达与分泌水平升高。划痕愈合实验结果表明乙醇刺激HepG2细胞VASN蛋白的分泌增加,可以促进HUVEC细胞的迁移。结论乙醇刺激导致HepG2细胞VASN蛋白表达水平和分泌水平升高,并可促进与其共培养的HUVEC细胞迁移。     

NIS基因转染对肝细胞癌NIS蛋白表达及摄碘功能的影响

目的:探讨肝细胞癌细胞核素靶向治疗方法。方法:提取NIS基因片段并构建重组质粒pcDNA3/NIS,将重组质粒导入肝细胞癌HepG2细胞。转染后24 h利用Western-Blot法检测HepG2细胞NIS蛋白表达,采用125I结合试验评估转染后细胞的摄碘率,采用DAPI染色法评估HepG2细胞摄125I后的凋亡情况。实验组与对照组之间NIS蛋白表达、摄碘率以及细胞凋亡率比较采用t检验。结果:蛋白电泳表明经NIS基因转染后,实验组HepG2细胞已表达NIS蛋白,表达强度显著高于对照组（t=2.693, P<0.05）。实验组HepG2细胞摄碘率B/T%平均为（18.4±5.8）%,显著高于对照组（t=36.842, P<0.05）。结合125I后24 h,实验组凋亡细胞数多于对照组,平均凋亡率为（19.2±5.3）%,显著高于对照组（t=3.086, P<0.05）。结论:转染外源性NIS基因可上调肝细胞癌HepG2细胞NIS蛋白表达,使其具备摄碘功能,加快细胞凋亡,为放射性碘靶向治疗提供实验依据。     

下调HIF-2α基因对低氧诱导的肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨下调缺氧诱导因子2α(Hypoxia-inducible factor 2α,HIF-2α)基因对人肝癌细胞株HepG2 低氧状态下增殖、凋亡、细胞周期分布和迁移侵袭力的影响。方法:选取氯化钴(CoCl2 )诱导的人肝癌细胞株HepG2 作为研究对象,构建HIF-2αsiRNA 特异性载体,转染低氧环境下的HepG2 细胞,Real-time PCR 和Western blot 方法分别检测转染前后细胞中HIF-2αmRNA 和蛋白表达,MTT 方法检测转染前后HepG2 细胞增殖,流式细胞术检测转染前后HepG2 细胞凋亡和细胞周期分布,Transwell 试验检测转染前后HepG2 细胞侵袭迁移能力。结果:低氧诱导下,肝癌HepG2 细胞HIF-2α表达显著增多;特异性转染HIF-2αsiRNA 于低氧环境下的HepG2 细胞后,HIF-2αmRNA 和蛋白表达水平均受到明显抑制、细胞增殖能力降低,凋亡率升高,分布于G0/ G1 期细胞比率升高,合成期(S)及合成后期(G2/ M)细胞比率降低,细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.05)。结论:低氧环境下肝癌HepG2 细胞表达HIF-2α增多,特异性siRNA 可通过下调低氧环境下HepG2 细胞中HIF-2α基因表达,抑制HepG2 细胞增殖、侵袭迁移,改变细胞周期分布并诱导其凋亡。     

乙型肝炎病毒对载脂蛋白B表达的影响及其机制探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对载脂蛋白B(ApoB)表达的影响,并探讨其调节机制.方法 采用RT-PCR和Western blot法检测HepG2和HepG2.2.15中ApoB mRNA和蛋白的表达,全自动生化分析仪Olympus 5400检测HBV患者和健康对照者ApoB血清学水平,分析健康对照者、慢性乙型肝炎、肝纤维化和肝癌患者中ApoB表达水平的差异,将HBV感染性克隆pHBV1.3转染HepG2细胞,RT-PCR和Western blot法检测ApoB和微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)表达水平的变化.结果 HepG2.2.15细胞中ApoB mRNA和蛋白的表达水平较HepG2低;ApoB在慢性乙型肝炎患者和肝纤维化患者的血清学水平明显低于健康对照者(P＜0.05);HBV能够在mRNA和蛋白水平抑制ApoB和MTP的表达.结论 HBV可能通过抑制MTP的表达抑制ApoB的合成和分泌.

Abstract：

Objective To explore the effect of hepatitis B virus(HBV) on the expression of apolipoprotein B(ApoB) and its regulatory mechanism. Methods mRNA and protein expression of ApoB in HepG2 and HepG2.2.15 cells was measured by RT-PCR and Western blot, serum ApoB levels in patients with HBV infection and in healthy individuals were measured by biochemical analyzer Olympus 5400, the expression of ApoB difference among healthy individuals, patients with chronic hepatitis B, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma were analyzed, HBV infectious clone pHBV1.3 was tranfected into HepG2 cells,and expression of ApoB and microsomal triglyceride transfer protein(MTP) was measured by RT-PCR and Western blot. Results Expression of ApoB mRNA and protein was lower in HepG2.2.15 cells than in HepG2 cells, serum apoB levels was much lower in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis as compared to healthy individuals( P ＜0.05 ), HBV could inhibit the expression of ApoB and MTP at mRNA and protein levels. Conclusion HBV may downregulate the synthesis and secretion of ApoB via inhibits the expression of MTP.     

三氧化二砷对肝癌细胞HepG2迁移、侵袭和凋亡的影响

本文旨在探究三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞HepG2作用的最佳浓度,以及此浓度As2O3对HepG2细胞迁移、侵袭和凋亡的影响。本研究采用CCK-8法检验0、1、2、4、8、16、32μmol/L As2O3处理后HepG2细胞活力,计算半抑制浓度(IC50),并且观察IC50浓度As2O3作用12、24、48 h后HepG2细胞形态变化。通过伤口愈合实验和Transwell侵袭实验验证As2O3对细胞迁移侵袭能力的影响。Western blot和qRT-PCR实验检测As2O3对细胞迁移、侵袭及凋亡相关蛋白和基因表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,HepG2细胞活力随As2O3处理浓度的升高而降低,呈现剂量依懒性,其IC50为7.3μmol/L;8μmol/L As2O3处理24 h后,HepG2细胞发生明显凋亡,且其迁移和侵袭能力显著降低;此外,细胞中RhoA、Cdc42、Rac1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平下调,抑凋亡基因Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平显著下调,而促凋亡基因Bax、Caspase-3的蛋白和mRNA表达水平显著上调。以上结果说明一定浓度的As2O3能够抑制肝癌细胞迁移和侵袭,促进肝癌细胞凋亡。     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。