肺炎克雷伯氏菌SHV-28编码基因的克隆、测序及基因定位

以临床分离的一株肺炎克雷伯氏菌99-799株为研究对象，对其所产生的一种β-内酰胺酶编码基因的序列、亚型及基因定位进行研究。采用聚合酶链反应(PCR)，用β-内酰胺酶通用引物、blasHv引物扩增获得β-内酰胺酶及SHV型酶编码基因的片段，将SHV型酶PCR扩增产物克隆入pUCm—T载体，以双脱氧链终止法测定核苷酸序列，再通过GeneBank进行同源性检测确定其亚型和基因所在位置。肺炎克雷伯氏菌99—799株所含的一种β-内酰胺酶基因型为SHV型，与SHV-28编码基因序列完全相同，且位于细菌150bp的大质粒上，说明重庆地区有SHV-28亚型的存在。     

3株含qnr基因肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶的检测

目的了解临床分离含qnr基因,(质粒介导的喹酮类耐药基因)肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶的基因型别。方法琼脂稀释法测定3株临床分离含qnr基因肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类、喹诺酮类抗菌药物的耐药性,NCCLS表型确证试验进行产ESBLs菌株的表型鉴定、采用TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-13组、OXA-1组、OXA-2组、OXA-10组、PER-1、VEB-1β-内酰胺酶通用引物以及TEM、CTX-M-13组、OXA-1组全编码基因引物、I类整合酶基因引物进行PCR检测和DNA序列分析;同时对这些菌株进行PFGE检测。结果3株临床分离含qnr基因肺炎克雷伯菌均为产ESBLs菌株,ESBLs基因型别为CTX-M-14,其中2株细菌同时产生TEM-1型广谱β-内酰胺酶、1株同时产生TEM-1和OXA-30型广谱β-内酰胺酶,I类整合酶基因均为阳性;这些菌株对青霉素类、一代、二代、三代头孢菌素(头孢噻肟)以及多种喹诺酮类均显示耐药。3株菌株中有2株的PFGE谱型相同。结论临床分离含qnr基因肺炎克雷伯菌可同时产生CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶,引起多重耐药,并存在克隆传播,临床应加强检测。     

肺炎克雷伯氏菌K99-1029中的ESBLs基因型分析

目的 了解华山医院临床分离的肺炎克雷伯氏菌K99—1029菌株产生的超广谱β—内酰胺酶(ESBLs)的基因型。方法 编码框以外设计引物、PCR扩增K99—1029转移接合子中的ESBLs全编码基因，克隆人pHSG398质粒、表达，并对PCR产物进行测序分析其基因型。结果 K99—1029转移接合子所产生的三种酶编码基因序列分别与GenBank中TEM—1、SHV—12、CTX—M—3编码基因序列的同源性为100％；产SHV—12或门CTX—M—3克隆菌株对多数β—内酰胺类抗生素耐药，SHV—12和CTX—M—3对多数β—内酰胺类抗生素具有水解作用，CTX—M—3对头孢噻肟的水解能力明显强于头孢他啶；产TEM—1克隆菌株仅对青霉素类耐药，TEM—1对青霉素类有明显的水解作用。结论 临床分离的肺炎克雷伯氏菌K99—1029菌株同时产生TEM—1、SHV—12、CTX-M—3型酶，可导致对大多数的β—内酞胺类抗生素产生耐药性。     

新生儿医院产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌感染分离株耐药性及基因类型检测

目的 了解新生儿医院感染产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌分离株的耐药状况及β-内酰胺酶编码基因TEM、SHV、OXA、PER、GES、VEB、CTX型存在状况。方法 将我院2004年7月新生儿病房感染的14株肺炎克雷伯菌用全自动微生物鉴定和药敏分析配套卡进行抗生素敏感性检测和ESBLs检测，并采用聚合酶链反应及序列分析方法分析菌株内的超广谱β-内酰胺酶基因型。结果 14株产ESBLs的肺炎克雷伯菌药敏结果一致，氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、头孢他啶均耐药对阿莫西林／克拉维酸、哌拉西林／三唑巴坦也耐药，对亚胺培南敏感。均检出blacTX-M和blaTEM基因，未检出blasm,、扰noxA、blaPER、扰nGES和blaVEB基因。对blarm和blacTX-M基因扩增产物测序，经BLAST程序分析基因为TEM-1和CTX-M-3型。结论 本院感染流行的ESBLs肺炎克雷伯菌耐第三代头孢菌素和耐酶抑制剂，基因类型为TEM-1和CTX-M-3。新生儿属于ESBLs的高危人群，新生儿病房产超广谱β-内酰胺酶菌感染应引起各方关注。     

广州地区泌尿系统感染产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药特征和基因分型

目的：了解本地区泌尿系统感染产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌耐药特征及其基因型分布。方法：收集广州地区13家医院2001年7月～2003年8月间临床分离的尿培养阳性肺炎克雷伯菌130株,采用NCCLs规定的ESBLs初筛和确证试验方法检测ESBLs,用K-B琼脂扩散法进行药物敏感试验,并应用聚合酶链反应（PCR）方法对所分离的产ESBLs菌株进行SHV、CTX-M基因型检测。结果：产ESBLs肺炎克雷伯菌检出率为41．5％（54株）,其中66．7％（36株）携带CTX-M基因,53．7％（29株）携带SHV型基因,并有20．4％（11株）同时携带CTX-M基因和SHV型基因。产酶株的耐药率明显高于非产酶株,产ESBLs细菌对青霉素类、环丙沙星及头孢菌素类耐药率较高（高达75．9～99．7％1,加酶抑制剂克拉维酸或他唑巴坦后耐药率有明显下降。结论：广州地区泌尿系统感染的产ESBLs肺炎克雷伯菌具有多重耐药的特点。其中CTX-M型是流行的基因型。     

肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

目的研究肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药机制。方法采用浓度梯度法(Etest)测定细菌对各种抗菌药物最低抑菌浓度,聚合酶链反应(PCR)扩增β-内酰胺酶基因,并对扩增产物进行基因测序,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行外膜蛋白(OMP)分析。用抑制试验进行主动外排机制检测。结果4株菌株全部携带有SHV-12型和DHA-1型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因,3株携带CTX-M-14型ESBLs基因;4株菌外膜蛋白分析发现,肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药株与敏感株相比,缺少分子量在32500~47500之间的一条带,从位置判断该条带可能为OMP 36000或OMP 37000的一种外膜蛋白;主动外排检测全部为阴性。结论同时产多种β-内酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是导致本组肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药的原因。     

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。     

粘质沙雷菌中SHV型β-内酰胺酶编码基因的克隆及序列分析

目的研究重庆地区临床分离的粘质沙雷菌E121编码超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的基因。方法PCR扩增ESBLs编码基因片段，克隆入pUCm—T载体，双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定亚型，等电聚焦测定β-内酰胺酶的等电点（pI）。结果PCR扩增结果显示粘质沙雷菌E121产生的ESBLs为SHV型，其基因片段含756个核苷酸，GenBank查询其核苷酸序列与SHV-28型ESBLs完全相同。该耐药株至少含有等电点pI约为5．4和8．2的两种β-内酰胺酶。结论重庆地区粘质沙雷菌E121所产ESBLs亚型为SHV-28。     

肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、氯己定-磺胺耐药基因研究

目的了解20株对亚胺培南敏感的肺炎克雷伯菌(Kpn)β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、氯己定-磺胺耐药基因存在状况。方法对20株Kpn菌进行了16种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因、氯己定-磺胺耐药基因检测。结果20株Kpn菌检出blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-9群、blaOXA-1群和blaDHA等6种β-内酰胺酶基因,阳性率分别为85%、25%、25%、20%、25%和70%。20株中有19株至少检出1种β-内酰胺酶基因,最多同时检出6种β-内酰胺酶基因;有19株检出氨基糖苷类修饰酶基因(95%);18株检出qacE△1-sul1基因(90%)。结论该20株Kpn菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗菌药物耐药与产β-内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶密切相关。     

SHV型超广谱β-内酰胺酶的研究进展

β-内酰胺酶的产生是细菌对β-内酰胺抗生素耐药的主要机制。SHV型超广谱β-内酰胺酶在革兰阴性耐药菌中普遍存在,并通过不断的点突变,拓宽了酶活性谱或增强了耐受β-内酰胺酶抑制剂的能力。现就SHV型超广谱β-内酰胺酶研究进展作一综述。     

肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶基因分型研究

目的调查广州地区下呼吸道感染肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的分离率及各种基因型的流行病学分布。方法收集广州地区13家医院2001-10～2002-12临床分离的肺炎克雷伯菌511株,采用美国临床实验室标准化委员会规定的ESBL表型筛选和确证试验确定ESBL的发生率、PCR扩增对产ESBL菌初步分型,然后对部分PCR扩增阳性产物测序,序列分析进一步确定基因型。结果肺炎克雷伯菌产ESBL分离率为40.1%。TEM型49株占21.9%,均为TEM-1型;CTX-M型59株占28.8%;SHV型96株占46.8%。结论SHV型是广州地区下呼吸道感染肺炎克雷伯菌产ESBL流行的常见基因型。     

肺炎克雷伯菌临床分离株产广谱和超广谱β-内酰胺酶的基因型研究

目的 了解产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性及其基因型分布特征,指导临床进行抗感染治疗,更好地控制耐药菌株的播散.方法 对38株经双纸片试验确认为ESBLs表型阳性的肺炎克雷伯菌采用纸片扩散法进行药物敏感性试验;采用PCR法对ESBLs阳性株进行TEM型、SHV型、CTX-M型、VEB型和PER型ESBL基因检测,对PCR阳性产物进行测序确定基因型别;同时采用PCR法检测整合酶基因,对PCR产物进行测序确定整合酶类别.结果 38株产ESBLs的肺炎克雷伯菌对青霉素类和头孢菌素类耐药性十分严重,对庆大霉素和复方磺胺甲嚼唑的耐药率也均＞90%,未检测到耐亚胺培南和美罗培南的菌株.38株ESBLs阳性菌株检测到3种ESBLs型,分别为TEM型、SHV型和CTX-M型,VEB型和PER型没有被检出.CTX-M型、TEM型和SHV型阳性率分别为92.1%(35/38)、84.2%(32/38)、76.3%(29/38).整合酶基因阳性率为94.7%(36/38).经测序,所有TEM型均为TEM-1广谱β内酰酶.29株SHV型阳性的PCR产物经测序证实,SHV-12有19株,SHV-11有4株,SHV-2有3株,SHV-28有2株及SHV-1有1株.35株CTX-M型中,CTX-M-14有22株,CTX-M-15有13株.同时检测到3种基因的有22株(57.9%),同时检测到2种基因的有14株(36.8%).整合酶基因PCR产物经测序为Ⅰ类整合子.结论 产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性及多重耐药性严重,Ⅰ类整合子是其多重耐药和耐药性传播的主要原因;CTX-M-14及SHV-12为肺炎克雷伯菌产ESBLs的主要基因型.     

PICU临床产ESBLs菌耐药特征及基因型分布的研究

目的 对产广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌进行初步基因分型,了解产ESBLs细菌的耐药基因的型别分布和耐药特征变化情况.方法 收集分离鉴定菌株,通过K-B法药敏实验初筛以确认产ES-BLs菌株,并对ESBLs基因进行初步分型.结果 分离到产ESBLs细菌93株,其中肺炎克雷伯菌为48株,大肠埃希菌为45株,产ESBLs细菌对青霉素类、氨曲南及头孢菌素类耐药率约为51.1％～100％,对美罗培南耐药为4.4％.对2010年检测到的产ESBLs菌株43株进行初步基因分型,PCR初步分型结果表明:43株ESBLs茵检测到CTX、SHV及TEM三种基因型;主要为CTX-M型占27.9％,包括CTX-M-14和CTX-M-3,其次为SHV型占25.6％,TEM型占9.3％.结论 产ESBLs细菌耐药率明显增高,且具有多重耐药的特点;产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯茵基因分型以CTX-M-14为主、其次为SHV型.     

我院临床分离的26株铜绿假单胞菌耐药性及其所产β-内酰胺酶的基因型分析

目的:了解我院临床分离的铜绿假单胞菌的耐药性及其所产β-内酰胺酶的基因型。方法:采用VITEK32型全自动细菌鉴定仪对临床分离的26株铜绿假单胞菌进行细菌鉴定,采用琼脂扩散法检测其对16种常用抗菌药物的耐药性,采用聚合酶链反应法对其进行基因检测,靶基因为TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1等7种β-内酰胺酶基因,然后对检测的阳性产物进行测序,并对照GenBankDNA序列数据库确定基因类型。结果:26株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌,耐药性分析结果表明其对其中12种常用抗菌药物有不同程度的耐药性,通过基因对照确定26株铜绿假单胞菌所产的β-内酰胺酶均为TEM-1型基因。结论:本组26株铜绿假单胞菌所产β-内酰胺酶可能主要为TEM-1型基因,具有多重耐药性。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯氏菌的耐药性及脉冲场电泳分型

摘要：目的研究临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(EsBLs)肺炎克雷伯氏菌的耐药表型及其同源性。方法利用E试验测定菌株的MIC，脉冲场电泳(PFGE)技术进行基因分型。结果大部分菌株属于多重耐药株，但均对亚胺培南敏感，PFGE分型可分为26型。结论该院存在多克隆株的小型传播，PFGE是一种可靠的基因分型方法。     

β-内酰胺酶抑制短肽SIPIS04-01的表达、纯化与抑制作用测定

通过酵母双杂交系统从一个随机DNA片段文库中筛选到一个编码能与β-内酰胺酶结合的短肽SIPIS04—01的DNA序列，将它克隆到pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pYG205。当用适量的IPTG诱导后，携带pYG205的E．coli DH5α能表达短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白。利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析介质分离纯化短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白，经凝血酶切割并分离纯化后，体外试验表明短肽SIPIS04-01具有抑制β-内酰胺酶的作用。     

大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药机制的研究

目的 探讨大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸的耐药特点和机制,为临床合理用药提供依据.方法 收集四川大学华西医院2005年5月至12月临床分离的544株大肠埃希菌经微量肉汤稀释法确认对氨苄西林/舒巴坦耐药的大肠埃希菌,从中随机选取276株用药敏纸片检测,仅52株对阿莫西林/克拉维酸耐药.对符合耐酶抑制剂β-内酰胺酶耐药表型的2株大肠埃希菌进行TEM型β-内酰胺酶基因的克隆表达.采用多重PCR技术检测耐阿莫西林/克拉维酸大肠埃希菌的TEM、SHV、OXA型3种β-内酰胺酶.结果 52株大肠埃希菌含TEM型46株,SHV型1株,OXA型6株.其中同时含TEM型和SHV型1株以及含TEM型和OXA型5株.结论 TEM-1型广谱酶的高产是华西医院大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药主要机制,另外本次研究首次在西南地区发现OXA-1型ESBLs,也是造成耐药的重要机制.     

某三级甲等医院肺炎克雷伯菌耐药性及耐药基因分析

目的:分析某三级甲等医院连续4年肺炎克雷伯菌的耐药性及耐药基因分布,了解耐药性变化趋势,指导临床合理用药。方法:使用VITEK-32全自动微生物分析仪进行细菌鉴定,用纸片法和最低抑菌浓度(MIC)试验进行药敏分析,用聚合酶链式反应(PCR)对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株可能携带的主要β-内酰胺酶耐药基因进行检测。结果:在182株临床分离的肺炎克雷伯菌中,痰和咽拭子标本分离率占首位(78.6%);对检测的13种抗菌药物耐药谱分析显示,该菌对哌拉西林耐药率最高,对亚胺培南和美罗培南敏感;产ESBLs菌株的检出率约30%;51%以上的产ESBLs菌株携带至少1种所检测的耐药基因,以blaTEM为主。结论:该院肺炎克雷伯菌分离株耐药范围广、产ESBLs菌检出率高,应引起重视。     

肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究

目的探讨我院肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因分布规律。方法对20株经双纸片试验确证为ESBLs表型阳性的肺炎克雷伯菌进行bla TEM-1、blaSHV-1、CTX—M-1组、TOHO-1组等4种基因PCR扩增，并对16株blaSHV-1基因PCR扩增阳性的菌株进行基因序列测定，在Internet网上与GenBank中的已知序列进行核苷酸相似性分析，并进行编码基因对位和氨基酸序列对比分析。结果产ESBLs肺炎克雷伯菌中blaTEM-1，blaSHV-1，CTX—M-1组等3种基因扩增阳性率分别是50．0％、95．0％、20．0％。16株肺炎克雷伯菌中有4株序列与SHV—1a（序列号：X98101，74→934）氨基酸序列完全相同；有3株序列与SHV-2（序列号：AY570959，42→812）100％相同；有2株序列与SHV-11（序列号：AY293069，41→817）100％相同；有4株序列与SHV-27（序列号：AF293345，2→821）氨基酸序列完全相同；有1株序列与SHV-28（序列号：AF538324，12→823）100％相同；有2株序列在GenBank中未找到与之完全相同的序列。结论本地肺炎克雷伯菌中有SHV—1a、SHV-11、SHV-28广谱β-内酰胺酶基因和SHV-2、SHV-27 ESBLs基因存在。     

产超广谱β内酰胺酶细菌分型与第3代头孢菌素治疗的关系分析

目的研究临床分离的30株产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)类型与应用第3代头孢菌素治疗的关系.方法回顾性分析2001-01～2002-07选取的26位产ESBLs细菌感染患者应用第3代头孢菌素治疗情况.用接合试验、聚合酶链反应、PCR产物克隆测序鉴定从上述患者体内分离的产ESBLs细菌的β内酰胺酶类型.结果大多数(86.2%)患者1周内接受了第3代头孢菌素治疗,头孢他啶12例次,头孢曲松12例次.PCR结果显示,肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的CTX-M、TEM、SHV基因阳性分别为4,6,9株和11,15,1株.其中,CTX-M型ESBLs 4种亚型,SHV型ESBLs 2种亚型.SHV型β内酰胺酶主要分布于肺炎克雷伯菌中(P＜0.01),头孢他啶治疗组中CTX-M型ESBLs占58.3%,头孢曲松治疗组占66.6%(P＞0.05).结论质粒介导的CTX-M型ESBLs的传播是影响ESBLs类型分布的主要因素.