H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

人颗粒溶素的原核表达

目的克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达。方法体外培养外周血单个核细胞并抽提总RNA,RT．PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,鉴定正确后构建原核表达质粒pET—GNLY9K和pET—GNLYl5K,并将其转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS—PAGE和Western—blotting鉴定融合蛋白的正确性。结果成功构建了原核表达载体pET—GNLY9K和pET—GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量分别约为31和37kD的融合蛋白。结论利用原核表达体系成功表达了不同相对分子质量的颗粒溶素融合蛋白。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

人S-腺苷蛋氨酸脱羧酶α亚基的克隆、表达与纯化

目的：构建人S 腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)的α亚基的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达的重组蛋白。方法：从大肠癌细胞中提取总RNA，RT PCR方法扩增人SAMDCα亚基的cDNA片段801?bp，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx 4 SAMDC α。将重组表达质粒转化入E.coli JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6×His•Tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果：酶切鉴定和DNA测序显示，人SAMDC α亚基的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx 4且方向正确，SDS PAGE电泳显示表达出32kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6×His•Tag的融合蛋白，且Ni NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论：成功构建、表达且纯化了重组SAMDC α亚基，为制备抗SAMDC抗体、研究SAMDC基因与结直肠肿瘤的关系提供了必要的工具。     

人绒毛膜促性腺激素α亚基cDNA克隆、表达及纯化

目的 从人绒毛膜组织中克隆人绒毛膜促性腺激素α亚基(HCGα)cDNA，构建表达载体并进行了表达、纯化，为进一步研究HCGα在多种肿瘤及异常妊娠中的作用作前期准备。方法 提取新鲜人绒毛膜组织总RNA，利用RT—PCR技术扩增出HCGα cDNA，克隆于表达载体PGEX4T-1，酶切鉴定后测序，测序证实序列正确，并转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达融合蛋白GST-HCGα。超声破菌后上清经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化，沉淀包涵体经变性：透析复性等处理，用SDS—PAGE电泳、Western印迹分析产物。结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示RT—PCR扩增片段大小约280bp，同预计片段相符。SDS—PAGE电泳显示诱导表达的产物经初步处理后有36kd左右的一条明显新增条带，与预期分子量相符，Western印迹证实此结果。融合蛋白主要以包涵体形式存在。结论 成功地从人绒毛膜组织中克隆出HCGα cDNA，克隆基因在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，表达产物有较好的免疫特异性。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

融合蛋白弓形虫主要表面抗原P30-CTXA2/B在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆并表达含有刚地弓形虫主要表面抗原P30及霍乱毒素A2 /B亚基基因的原核表达载体 ,为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法 :通过PCR方法扩增出P30基因片段 ,将其克隆入含有霍乱毒素A2 /B亚基基因的表达质粒pUAB0 2 4 ,在大肠杆菌JM10 9(DE3)中表达融合蛋白。行SDS PAGE电泳及West ernblotting检测鉴定。结果 :酶切电泳证明质粒构建正确。SDS PAGE显示IPTG诱导可以产生特异性条带。Westernblotting进一步证实该条带为p30 CTA2 /B融合蛋白。结论 :成功构建的表达载体pUAB0 2 4 p30可有效表达特异性的融合抗原蛋白P30 CTA2 /B。     

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白．方法：应用PCR方法从人外周血白细胞eDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His—C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定．应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析．结果：成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C220rf37／DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS—PAGE电泳分析,在Mr约18000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合．应用Ni—NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80％．结论：成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础．     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。     

GST Pulldown技术检测HEK293T细胞活化的Rab35

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中活化的Rab35的可靠检测方法?方法:构建GST-RUN的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21中大量表达?用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Rab35及Rab35蛋白的表达?结果:成功构建了GST-RUN的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RUN,用GST Pulldown和Western blot技术证实了HEK293T细胞中有活化的Rab35和Rab35总蛋白的表达?结论:本工作所建立的GST Pulldown技术可以检测HEK293T细胞中活化的Rab35,从而为进一步深入研究Rab35在真核细胞中的功能提供了技术保障?     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。     

人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白表达载体的构建

目的获得含人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达载体。方法构建含人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的原核表达载体,其中人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因由接头序列连接而成,该接头序列编码产物为富含甘氨酸的短肽。结果通过基因的扩增、重组等构建了人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因的原核表达载体。结论获得了人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的原核表达载体,为进一步进行脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达及纯化,建立表达具有生物活性的脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的方法,提供前期研究。     

人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1)cDNA,构建原核表达质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并诱导表达谷胱甘肽疏基转移酶-hGLP-1(GST-hGLP-1)融合蛋白。方法：采用亚磷酸二酯法合成6个hGLP-1cDNA的寡核苷酸片段,拼接成完整的hGLP-1cDNA,克隆至pBSSK( /-)载体中,经双酶切鉴定和测序后把hGLP-1cDNA定向插入融合基因表达体pGEX-4T-3的多克隆位点上,构建重组质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并转化大肠杆菌TG1。结果：经限制性内切酶合蛋白GST-hGLP-1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hGLP-1创造条件。     

8R-MUC1核心肽融合蛋白的原核表达及纯化

目的：构建蛋白质转导结构域8个精氨酸聚合体（8R）与MUC1核心肽融合蛋白的原核表达载体,并表达、纯化出具有生物学活性的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 方法：以PCR法从HSP65-MUC1-pET28a质粒中钓取MUC1核心肽2个重复序列片段,连入pMD18-T载体,然后用酶切、连接的方法从T载体上获得MUC1核心肽6重复序列片段(MUCPT),将其克隆入含8R的pET26b⁺原核表达载体中构建8R与MUCPT融合蛋白（8R-MUCPT）表达载体。用IPTG诱导转化8R-MUCPT表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化8R-MUCPT融合蛋白。 结果：构建了8R与MUC1核心肽6个重复序列片段的融合蛋白原核表达载体8R-MUCPT-pET26b⁺,并在BL21(DE3)中表达了8R-MUCPT融合蛋白,经镍螯合层析获得纯度为95.5%的8R-MUC1核心肽融合蛋白。 结论：构建了8R-MUC1核心肽融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出具有生物学活性的融合蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。