荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓间充质干细胞研究

目的:探索高效体外示踪骨髓间充质干细胞体系的方法。方法:采用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞CD29、CD90和CD45表达情况,用诱导剂诱导干细胞检测骨髓间充质干细胞的分化能力,采用普鲁士蓝染色,用激光共聚焦显微镜、磁共振成像仪观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体外成像效果。结果:流式细胞仪检测CD29、CD90和CD45阳性表达率分别为84.69%、90.28%和0.72%;碱性磷酸酶染色和油红O染色结果均表明骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞和脂肪细胞;普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜成像和磁共振成像表明荧光磁性纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞具有很好的成像效果。结论:荧光磁性纳米粒子作为示踪剂可以在体外标记骨髓间充质干细胞,为干细胞研究提供新思路。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞的研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchyrnal stem cells，BMSCs)体外分离培养、诱导分化为脂肪细胞的方法，并研究其生物学特性的变化．方法：采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养．用地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、吲哚美辛定向诱导BMSCs分化为脂肪细胞，改良MTT法测定其生长曲线，油红O染色，光镜下观察橙红色脂滴沉着的细胞比例．结果：成脂诱导72h后，细胞内有脂滴出现，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增加并融合为脂泡；细胞由梭形转变为类圆形或多角形；第3周油红O染色显示80％以上的细胞转变为脂肪细胞．结论：兔BMSCs经体外分离、诱导培养可以定向分化为脂肪细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究

目的 探索小鼠骨髓间充质干细胞的体外纯化培养方法.方法 先采用直接贴壁法培养的小鼠股、胫骨髓细胞,再用免疫磁珠法分选第3代中的CD11b-细胞.取分选纯化细胞进行形态学观察,并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力.结果 ①原代及传代培养的小鼠骨髓贴壁细胞多呈梭形,部分呈不规则型,其中含有较多的CD11b 细胞;磁珠分离后的纯化细胞呈现纺锤型、星型及不规则型等多种形态,细胞质丰富,核仁明显,细胞平行排列或漩涡状生长;②成骨诱导3周后mMSCs分化为成骨细胞,茜素红S染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积;③随着成脂化诱导时间的延长,细胞逐渐增大,油红O染色可见胞质内大量橙红色脂肪空泡.结论 单纯的贴壁及传代培养不能纯化小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁与免疫磁珠分离相结合才是一种有效的mMSCs体外分离和纯化方法.     

成人骨髓间充质干细胞的体外诱导培养及向脂肪细胞的定向分化

目的：确定人骨髓的间充质干细胞(MSCs)体外培养扩增、培养，向脂肪细胞表型转化的方法，并了解其生物学特性变化。方法：用Percoll分离液(1．073g／ml)分离成人MSCs，传代培养。流式细胞仪检测表面标记物CDl4，CD34，CD45，CD44，VLA—1，HLA—DR和细胞周期，用1—甲基—3—异丁基—黄嘌吟、吲哚美辛、牛胰岛素、地塞米松实现向脂肪细胞的定向诱导分化。油红O染色，光镜下观察橙红色脂滴沉着的细胞比例。结果：分离培养获得贴壁细胞，流式细胞仪检测CDl4，CD34，CD45，HLA—DR阴性，CD44阳性，VLA—1表达微弱。G0／G1期细胞约为86％。诱导72h后出现脂墒，第3周油红O染色示85％以上细胞转变为脂肪细胞。结论：从人骨髓分离、体外诱导培养间充质干细胞，可定向促进向脂肪细胞表型转化。     

大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

目的 分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞(CSSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs),比较两种间充质干细胞体外成骨、成脂诱导的差异.方法 采用出生后5天的SD大鼠,分离培养CSSCs和BMSCs,并进行鉴定.体外对CSSCs和BMSCs进行成骨成脂诱导,采用免疫荧光检测,碱性磷酸酶(ALP)染色,茜素红染色,油红O染色...     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物,并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。生长曲线呈S形,细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期,保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。     

骨髓间质干细胞在糖尿病性骨质疏松发病中的作用

1型或2型糖尿病人患骨质疏松症和发生骨折的风险明显增加,其机制可能是由于骨髓间质干细胞(BMSCs)的耗竭。糖尿病通过高血糖等多种因素影响成骨细胞功能和骨形成,诱导骨髓细胞中脂肪累积,减少可用于骨形成的成骨细胞的数量,其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ在BMSCs向成骨细胞或脂肪细胞分化上起着关键的闸门作用。由于糖尿病降低骨密度主要通过影响骨形成而非骨吸收,增加成骨细胞产生和禁止BMSCs流向脂肪细胞的途径,在理论上是预防和治疗糖尿病骨质疏松症的最根本方法。     

利塞膦酸钠抑制大鼠骨髓内脂肪细胞分化及脂肪细胞核因子κB受体活化因子配体蛋白的表达

目的研究利塞膦酸钠（RIS）对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响及对骨髓内脂肪细胞来源的核因子κB受体活化因 子配体（RANKL）的调节作用,为阐明RIS抗骨质疏松的机制提供新的理论依据。方法大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导及非 成脂诱导14 d,期间以浓度梯度0、1、5、10、25 μmol/L的RIS进行药物干预,观察并计算成脂率,提取蛋白通过Western blot实验 检测RANKL蛋白表达。将24周的SD大鼠随机分成假手术组及OVX组,12周后OVX大鼠再次随机分为RIS干预组（2.4 μg/kg, 皮下注射,3次/周）及对照组。8周后行骨密度检查,并取大鼠左股骨远端骨骼标本行病理检查,观察RIS对大鼠骨髓内脂肪含 量的影响。结果体外实验发现RIS呈浓度依赖性抑制大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,并且,随着RIS浓度的升高,骨 髓内脂肪细胞RANKL蛋白的表达逐渐降低（P<0.05）。体内实验发现RIS药物干预后,OVX大鼠骨密度显著提升的同时,骨髓 内脂肪的含量明显降低（P<0.05）。结论RIS可有效抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化,降低骨髓内的脂肪含量,并通过下 调脂肪细胞RANKL的表达,抑制破骨细胞的生成和功能,这可能是RIS发挥抗骨质疏松作用的机制。     

源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能

目的: 研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能,初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法: 将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化,分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养液中进行悬浮培养,并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体(SDDSs),用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果: 真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs;在含血清的单层培养条件下,从SDDSs分离培养的细胞增殖活跃,细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白;分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后,呈现类似于BMSCs分化特点,分化的细胞呈茜素红、番红O和油红O特殊染色阳性反应,但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论: 结合无血清培养和有血清培养法,可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞,此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

骨髓间充质干细胞体外培养及肝向分化方案的优化

目的优化一套简便、可靠、稳定的大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及肝向分化的方案。方法采用全骨髓差速贴
壁法分离提取大鼠骨髓间充质干细胞,通过优化的1.5 h差速贴壁结合12 h首次全量换液方法,及体外改良培养方案实现细胞
高效纯化扩增。流式细胞术表面标志物检测结合成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定细胞群。采用添加bFGF、HGF、EGF等多种
生长因子的三步诱导法促使骨髓间充质干细胞向肝系分化,并进行形态学、免疫学、基因水平评估。结果分离纯化的细胞群阳
性表达CD29、CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45,经成脂、成骨、成软骨诱导液作用后,油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色均呈阳
性。经三步法肝向诱导处理后,细胞群呈肝样细胞形态改变,表达肝脏特异性标志物ALB、AFP,肝系相关基因表达水平呈时间
依赖性逐渐上升。结论优化后的方案能够简便、可靠、稳定地获得高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,并能在特定微环境作用下
实现肝向分化。