人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的 克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列,并在原核细胞表达。方法 按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT－PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片段亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果 从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质,与预期值一致。结论 从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

尿激酶受体在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备

构建尿激酶受体表达质粒并在大肠杆菌中表达，用纯化的表达产物ｕＰＡＲ蛋白制德多克隆抗体并初步应用于肿瘤标本的检测。方法 用基因工程的方法构建ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ表达质粒ｐＬＹ４－ｕＰＡＲ，转化重组大肠杆菌在４２℃条件下诱导表达；利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行优化并用纯化后的抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，应用制备的抗体对乳腺癌和肝癌中ｕＰＡＲ的分布进行检测。     

日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因的克隆、表达和初步鉴定

目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Ts4样融合蛋白。方法提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因编码序列,T载体连接,将其亚克隆入PGEX-5X-1载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌DH5α并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约为870bp的片段,表达质粒PGEX-5X-1-SjTs4经双酶切和以该重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约58ku大小的GST融合蛋白条带,并可与抗GST特异性抗体反应。结论本实验成功地克隆了日本血吸虫Sj-Ts4样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）基因,并使其在原核细胞中获得表达。方法 先从人胚胎肝脏中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ获得编码氨基端１９５个氨基酸残基的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ。将该片段亚克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ克隆质粒中,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ插入到原表达质粒ｐＥＴ２８－ａ中,转化大肠杆菌ＢＬＲ２１（ＤＥ３）,进行诱导表达,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法及免疫印迹法进行检测。结果 得到的ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ与文献报道的序列完全一致。经诱导后ｈＴＰＯ基因在大肠杆菌中获得表达,目的蛋白占总菌体蛋白的１０％,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论 得到ｈＴＰＯ１９５ｃＤＮＡ,并在原核细胞中获得表达,得到截短形式的ｒｈＴＰＯ１９５。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH，获得重组融合蛋白OprF／H，为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因，扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后，割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒，测序后构建表达质粒pGEX-F／H，并转化大肠杆菌BL21。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF／H。结论 成功构建融合外膜蛋白OprF／H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功。