胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及其生长特性和表型

间充质干细胞（MSC）是一种具有多向分化、体外扩增、自我更新能力的细胞。本研究旨在分离rMSCs，并观察其类型特征及生长特性。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的：探索高效分离和扩增人脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs）的方法,观察其生物学特性,并通过形态学、免疫表型及多向分化能力进行鉴定。方法：以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,体外扩增后传代,倒置显微镜观察,MTT比色法测定细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达。在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、IBMX、吲哚美辛的诱导下向脂肪细胞定向分化;在DMEM及胎牛血清培养基、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、胰岛素的诱导下向成骨细胞定向分化。结果：原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好。细胞传代后2天内处于潜伏期,第3天进入生长期,5天后进入平台期。流式细胞仪检测CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105阳性率分别为73.4%、3.6%、4.5%、2.0%、97.3%、80.4%。经定向诱导分化后,细胞分别呈现脂肪细胞、骨细胞的表型特征。结论：酶消化法能有效分离纯化人ADSCs,细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有ADSCs的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

骨髓间充质干细胞体外分离技术探讨

骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离，所使用的细胞分离液多为Percoll。我科自2002年至今多次对大鼠股骨、胫骨、骨髓腔骨髓干细胞进行抽取和分离，并采用不同的分离液（percoll和ficoll），分别对两种分离液进行离散密度，离心时间、速度、温度、培养基成份等各种条件下的实验研究，现将结果报道如下。     

人骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究

目的观察体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和生长规律,以证实人MSCs是一种理想的种子细胞,以及为进一步深入研究提供基础理论依据。方法对人骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs。观察原代、传代细胞的结构、生长情况,对第2代MSCs表面抗原进行测定。结果MSCs原代培养第14～16d时细胞融合成单层,传代细胞保持原代细胞的形态特征。超微结构显示:第2代MSCs细胞核形态不规则,部分核可见多个核仁,胞质内细胞器形态分化幼稚。细胞的生长曲线显示:传代第3d起呈对数生长,第5d达到高峰,10代后无明显克隆出现。P1代克隆形成率为25.83%±2.93%,P5代为14.67%±1.63%,P10代为4.67%±0.52%。MSCs的表型特征显示细胞均一性较好,MSCs表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。结论用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选法,可分离、纯化人MSCs,方法简单、经济,易应用;MSCs增殖能力强,可在体外大量扩增,能满足组织工程的要求,是理想的种子细胞之一。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

不同来源血清体外培养骨髓间充质干细胞的研究

目的 适当的血清浓度可维持骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养,而不同来源的血清对BMSCs的培养效果是否小同.本研究探讨自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清在体外培养人BMSCs的可行性.方法 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入白体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清,观察比较细胞形态、表面抗原、生长曲线及各组在诱导剂作用下表面抗原和诱导分化的相关性.结果 从BMSCs的形态学、生长曲线、表面抗原、诱导分化上看各组无明显差异,生长状况良好.结论 自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清均可维持BMSCs的体外培养,而自体血清解决异种和异体血清带来的一些潜在的风险,更为安全.     

应用脉冲电磁场刺激人骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性的研究

目的应用脉冲电磁场(PEMFs)刺激体外分离培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)，对其生物学特性进行研究。方法PEMFs(12Hz、1．1mT、8h／d)刺激hMSCs体外培养，计算细胞的倍增时间，观察细胞超微结构，放免法测定骨钙素的分泌情况和钙化结节Von Kossa染色。结果脉冲电磁场作用后的细胞增殖能力提高，细胞形态发生变化，透射电镜观察提示细胞成熟，Von Kossa钙染色阳性，骨钙素的分泌活性增高。结论hMSCs经合理的PEMFs体外刺激培养后，不仅能够大量扩增细胞，同时能够向成骨细胞转化，具有一定的成骨活性，是一种较为理想的骨种子细胞来源。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

化疗对结直肠癌患者骨髓间充质干细胞的影响

目的观察化疗对结直肠癌患者骨髓间充质干细胞（MSC）生物学行为的影响。方法分别采集43例结直肠癌患者化疗前、后的骨髓,进行MSC分离培养,观察MSC形态学及生长情况、纤维细胞集落（CFU-F）形成能力、MSC层粘附率和造血细胞混合集落的变化,ELISA检测MSC培养上清中IL-6、SCF、FLT-3L水平。以10例健康成人骨髓作为对照。结果化疗后患者CFU-F形成能力和造血支持功能均显著降低,MSC层粘附率下降,与化疗前及正常对照组比较差异显著,而后两组间差异无显著性;三组MSC培养上清中IL-6、SCF、FLT-3L水平有显著性差异。结论化疗可导致结直肠癌患者骨髓MSC功能损伤,其作用机制可能与造血因子表达下降有关。     

骨髓间充质干细胞与骨组织共培养模型的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)与骨组织共培养模型,模拟体内成骨环境,以全面研究骨髓间充质干细胞及细胞支架复合物的生物性状.方法:通过插入式培养皿和培养板来构建细胞一组织共培养的模型,将新鲜兔骨碎粒及骨块与骨髓间充质干细胞共培养,观察共培养条件下细胞的形态学变化、ALP活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.结果:构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型.共培养的间充质干细胞同期ALP活性高于普通培养对照组,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性,对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性.结论:体外构建的共培养模型部分模拟了体内成骨环境;经过共培养的细胞呈现成骨细胞的表型.     

神经干细胞与BMSCs移植治疗脊髓损伤的研究进展

目的综述神经干细胞(neural stem cells,NSCs)与BMSCs的免疫学特性及治疗脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)的新进展。方法广泛查阅近年国内外相关文献,对NSCs与BMSCs的免疫学特性、移植治疗SCI的实验研究与可能存在的问题进行分析。结果动物实验表明NSCs与BMSCs移植可促进SCI动物行为学改善,但由于两种干细胞的免疫学特性,同种异体干细胞移植后将产生免疫排斥反应。结论 NSCs与BMSCs对SCI有很好的治疗效果,但是免疫排斥问题值得考虑。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

同种异体血清在体外培养骨髓间充质干细胞的作用研究

[目的]适当的血清浓度可维持骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养,血清浓度过低不利于细胞的生长,而高浓度血清则易引起细胞分化。而血清的不同来源对MSCs的培养同样产生影响。传统的培养方法用胎牛血清作为营养支持,临床应用时存在潜在的风险。本研究探讨同种异体血清在体外培养人骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)的可行性。[方法]无菌条件下收集人骨髓悬液,分离hBMSCs,分别用含胎牛血清和人血清的培养基培养。分别测定2种方法培养的hBMSCs细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测分析培养的hBMSCs表面抗原类型;并将培养的hBMSCs诱导分化为软骨细胞及神经细胞,诱导后的软骨细胞及神经细胞采用免疫组化染色分析。[结果]2种方法培养的间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性,表达强度无显著性差异;人血清培养的hBMSCs细胞生长速度快于胎牛血清培养组,但分化效率低于后者。[结论]通过生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,人血清培养hBMSCs与胎牛血清培养差别不大,可以作为一种适合临床的安全培养方法。