小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

HCV重组体转染细胞系的研究

目的：建立ＨＣＶ重组体转染ＳＭＭＣ７７２１肝缲细胞模型。方法：采用ＦＵＧＥＮＥ＾ＴＭ６转染法，然后用ＲＴ－ＰＣＲ法测定细胞内重组体ｍＲＮＡ瞬时表达情况：结果：６７．５％的培养孔可筛选到转染细胞表达重组体ｍＲＮＡ。结论：该转梁法效率高，建立的细胞模型可用于筛选抗病毒转录的药物。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

角质形成细胞转染人乳头瘤病毒后c-jun、c-fos及MDM2基因的表达

目的 研究正常角质形成细胞转染人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６后，c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达情况。方法 在无血清的Ｍ１５４培养基上培养角质形成细胞，适当时进行传代培养。采用转染试剂ＦuＧＥＮＥ∧ＴＭ６将质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６转入正常角质形成细胞，应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测转染后角质形成细胞中c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达。结果 转染质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６后角质形成细胞形态的所改变，细胞变大，胞核结构疏松，胞浆出现颗粒。转染细胞株中，检测到ＨＰＶ１６mＲＮＡ的表达，扩增产物为１１０bp；同时检测到ＨＰＶ１６ＤＮＡ片断（７．９kb）。转染后角质形成细胞中有c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ的表达。结论 体外试验提示ＨＰＶ感染可能通过c－jun、c－fos、ＭＤＭ２的表达而促进细胞的增生。     

腺病毒介导神经生长因子对遗传性视网膜变性RCS大鼠？…

目的：探讨先天性视网膜变性病因以及对其进行基因治疗的可行性。方法：ＴＵＮＥＬ法对ＲＣＳ大鼠视细胞的丧失进行研究;构建分泌表达型重组腺病毒穿梭质粒ｐＨｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ,经与ｐＪＭ１７在２９３细胞中同源重组,获得复制缺陷型重组腺病毒ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ。琼旨糖覆盖法测定滴度。ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ和ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＬａｃＺ转导培养视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕ     

应用RT-PCR快速检测病毒性心肌炎患者血清中CVB-RNA

目的：探讨ＲＴ－ＰＣＲ在病毒性心肌炎中的诊断价值。方法：选用柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＶＢ）保守区５′－非编码区的组特异性引物,对４２例临床拟诊为病毒性心肌炎的患者血清行ＲＴ－ＰＣＲ,以检测ＣＶＢ－ＲＮＡ,同时采用间接ＥＬＩＳＡ检测血清中ＣＶＢ－ＩｇＭ。结果：心肌炎患者血清中ＣＶＢ－ＲＮＡ的检出率为６６７％（２８／４２）,而ＩｇＭ的检出率为５２４％（２２／４２）。结论：ＲＴ－ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ都是特异、敏感的诊断方法,并且ＲＴ－ＰＣＲ比ＥＬＩＳＡ敏感（Ｐ＜００５）     

黑色素瘤抗原-1基因在肝细胞癌中的表达

目的 检测黑色素瘤抗原－１（ＭＡＧＥ－１）ｍＲＮＡ在肝细胞癌（ＨＣＣ）中的表达,为用ＭＡＧＥ－１基因编码蛋白作为疫苗对ＨＣＣ患者进行免疫治疗提供依据。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对４５例ＨＣＣ患者组织和相应癌旁肝组织以及１６例肝硬化组织和１２例正常肝组织的ＭＡＧＥ－１ｍＲＮＡ表达情况进行了研究,对６例ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的目的基因片段进行ＤＮＡ序列测定,并以测序证实为ＭＡＧＥ－     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在 C H O 细胞中的表达

目的： 克隆造血干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ）并在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达。方法： 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从ｐ Ｒ Ｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ（含 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ）中钓取 Ｓ Ｃ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 膜外段活性区,克隆入真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,转染入 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞;用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。结果：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞可表达 Ｓ Ｃ Ｆｍ Ｒ Ｎ Ａ,其细胞培养上清可协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ刺激骨髓细胞形成集落数比 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 单独作用高 ２ 倍,转染外源基因对细胞周期没有明显影响。结论：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达,转染细胞上清协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 刺激骨髓细胞集落的形成,而本身对集落的形成没有影响。     

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序

目的：获取抗ＣＤ４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因，为构建抗ＣＤ４嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人ＣＤ４ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系中提取总ＲＮＡ，用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别扩增出重链可变区（ＶＨ）基因及轻链可变区（ＶＬ）基因。将ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后转化ＪＭ１０９细菌。并用全自动 ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ及ＶＬ基因序列进行测定。结果：ＶＨ基因为３５１     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

体外感染后巨细胞病毒即刻早期基因转录及细胞结构变化的研究

目的：研究巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染后即刻早期基因转录及细胞结构的变化。方法：用ＨＣＭＶＡＤ１６９株感染人胚肺成纤维细胞,通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）动态检测感染后不同时间ＨＣＭＶ即刻早期基因（ＩＥＧ）ｍＲＮＡ转录,同时在电镜下观察细胞结构变化的特点。结果：ＨＣＭＶ感染细胞６ｈＩＥＧｍＲＮＡ开始转录,并持续到９６ｈ;感染初期（６～１２ｈ内）胞体肿胀,内质网（ＥＲ）囊腔膨大,１２～２４ｈ可见典型的“猫头鹰眼”样包涵体,细胞变圆,晚期（４８ｈ后）细胞灶性脱落,胞质退缩,ＥＲ少见,核中见待出核的成熟病毒颗粒。结论：ＨＣＭＶＩＥＧ在病毒复制过程中持续转录,并伴有细胞结构的病理变化,因此ＨＣＭＶＩＥＧ可作为病毒活跃复制的监测指标。     

大鼠颌下腺血管内皮生长因子cDNA的转移及表达

目的：探讨以颌下腺为靶器官,进行血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因治疗后,颌下腺中ＶＥＧＦ含量变化。方法：构建了ＶＥＧＦ基因表达的真核细胞表达载体,以阳离子脂质体为介质,向大鼠颌下腺转染外源性的ＶＥＧＦ基因,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术观察ＶＥＧＦ基因的表达,ＥＬＩＳＡ方法检测颌下腺中ＶＥＧＦ的含量变化。结果：转ｐＢＫＣＭＶ－ＶＥＧＦ１２１基因后第１天,大鼠颌下腺内ＶＥＧＦ的表达及涎液中ＶＥＧＦ的含量即开始     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

内皮素A型受体（ET＿A－R）基因在大鼠心血管系统细胞中的表达

应用改良的Ｍａｒｔｉｎ（１９９３）定量反转录－聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙ－ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）方法，测定了大鼠ＥＴＡ型受体（（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－Ａｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＴＡ－Ｒ）ｍＲＮＡ在心血管系统细胞中的分布。结果证明，ＥＴＡ－ＲｍＲＮＡ广泛地分布在心血管系统细胞中．其中以平滑肌细胞中含量最高。内皮素及其受体的配基可以促进血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅｃｅｌｌ，ＶＳＭＣ）中ＥＴＡ－ＲｍＲＮＡ的表达。此外，还发现在自发性高血压动物的血管平滑肌细胞中ＥＴＡ－Ｒ基因的高表达可能是高血压血管高反应性的一个重要机制。     

检测人巨细胞病毒的免疫—PCR方法的建立

目的：依据免疫－ＰＣＲ基本原理，建立检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）活动性感染的免疫＿ＰＣＲ方法。方法：我们建立的免疫－ＰＣＲ方法与酶联免疫ＥＬＩＳＡ不同之处是，用ＰＣＲ扩增生物素化线性ＰＢＶ２２０ＤＮＡ代替ＥＬＩＳＡ的酶催化底物，经琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色观察分析扩增产物异条带，判断结果。结果：用本法检测ＨＣＭＶ的敏感性高于ＥＬＩＳＡ法１０＾３－１０＾５倍，可检测到５个感染ＨＣＭＶ细胞；而检测ＨＳ     

庚型肝炎病毒的检测和临床研究

１庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）的检测１１ＲＴ－ＰＣＲ法ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的检测，目前普遍采用的方法为ＲＴ－ＰＣＲ法，其敏感性、特异性均较好。但由于操作时间长，对人员、设备条件要求高，故大规模的流行病学研究还有待于可靠的ＥＬＩＳＡ检验抗体法的建...     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细