日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。     

日本血吸虫超氧化物歧化酶的表达与免疫活性鉴定

目的表达日本血吸虫胞浆内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),并研究其免疫原性。方法采用反转录PCR方法从血吸虫成虫mRNA中扩增出SOD基因序列,再亚克隆到表达载体pGEX-4T-3中构建重组表达质粒并转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG对含有重组质粒的转化子细菌进行诱导表达重组的GST-SOD蛋白。用重组GST-SOD蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫印迹试验观察重组GST-SOD融合蛋白的免疫原性。结果 日本血吸虫胞浆内SOD基因被成功地扩增,并构建成功含此基因的重组表达质粒Sj SOD-pGEX-4T-3。含重组质粒的E. coli在IPTG的诱导下能表达一大小约43 kDa的GST-SOD重组蛋白。用此蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平最高能达1: 12 800,该萤组蛋白可以被血吸虫重感染兔血清所识别。结论 日本血吸虫中国大陆株胞浆内SOD表达成功,并具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon 亚型基因的表达及鉴定

目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合成 1对引物 ,以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板 ,用RT PCR法合成日本血吸虫大陆株 14 3 3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK Sj14 3 3 ,转染到大肠杆菌BL2 1,双酶切鉴定后 ,通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL2 1中进行表达及Western blot鉴定。　结果　RT PCR产物、pGEM T Sj14 3 3及pBK Sj14 3 3分别经双酶切均获得一特异性基因片段 ,其表达产物经SDS PAGE及Western blot鉴定后其分子质量为 3 2ku ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。　结论真核表达重组质粒 pBK Sj14 3 3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为 3 2ku融合蛋白 ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的 在原核细胞中表达SjGST和Sj14-3-3的融合蛋白。方法 RT－PCR法从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，并转化E.coli BL21,IPTG诱导表达，Western-blot鉴定表达产物。结果 扩增产物约为765bp，重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后可得到一与PCR产物大小相同的DNA片段，经IPTG诱导后在55ku附近出现一新增蛋白条带，Western-blot结果显示，表达产物可被免抗鼠14－3－3ε多克隆抗体识别。结论 在原核细胞融合表达SjGST和Sj14-3-3成功。     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的　在原核细胞中表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3的融合蛋白。　方法　 RT- PCR法从日本血吸虫成虫总 RNA中扩增出 Sj14- 3- 3基因 ,亚克隆至原核表达载体 p GEX- 4T- 1,并转化 E.coli BL2 1 ,IPTG诱导表达 ,Western- blot鉴定表达产物。　结果　扩增产物约为 76 5 bp,重组质粒经 Bam H 和 Xho 双酶切后可得到一与 PCR产物大小相同的 DNA片段 ,经 IPTG诱导后在 5 5 ku附近出现一新增蛋白条带 ,Western- blot结果显示 ,表达产物可被兔抗鼠 14- 3- 3ε多克隆抗体识别。　结论　在原核细胞融合表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3成功。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

目的 在毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3（Sj14-3-3），并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。 方法 以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板，PCR扩增Sj14-3-3基因，将特异片段连接到pMD18-T载体, DNA序列分析后，亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后，重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株，经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达，取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 分析。 用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。 结果 目的基因已在酵母菌基因组中得到整合, PCR扩增得到约1 300 bp的片段。 经甲醇诱导，Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。 表达产物经SDS-PAGE 测定为 Mr 35 000。Western blotting 结果显示，Mr 35 000 蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别，表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明，该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体，阳性率为81％。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应, 32份健康人血清假阳性反应率为9.3％。以原核表达的rSj14-3-3为抗原，间接ELISA检测，36份急性血吸虫病患者血清的 rSj14-3-3 抗体阳性率为88.9％；与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7％, 32份健康人血清假阳性反应率为12.5％，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3，培养上清中产物丰度较高，且免疫反应性良好。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因[Parasitol1]真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK一Sj14—3—3，为进一步对重组蛋白的融合表达及保护性免疫的研究提供条件。方法 根据日本血吸虫14—3—3蛋白的核苷酸序列。设计合成一对引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA为模板，用RT-PCR法合成日本血吸虫中国大陆株14-3—3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM—T载体，经双酶切及PCR鉴定后，再亚克隆入pBK—CMV真核表达质粒，构建重组质粒pBK-Sj14—3—3，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，提取重组质粒双酶切鉴定并进行序列分析。结果 RT-PCR产物、pGEM—T-Sj14—3—3及pBK-Sj14—3—3分别经双酶切均获得一特异性基因片段．经测序分析后该片段具有一个753bp完整开放阅读框(open reading frame，ORF)，由此推导的氨基酸序列具有多种蛋白激酶的磷酸化位点。结论 成功地构建了日本血吸虫中国大陆株14—3—3信号蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒。并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列蛋白激酶磷酸化位点进行分析。     

6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的鉴定及初步应用

目的对6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体生物学特性进行鉴定,并探讨其在血吸虫病诊断中的应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对6株单克隆抗体的类和亚类、腹水效价、亲和常数、检测灵敏度和特异性进行测定与鉴定。建立检测日本血吸虫感染兔血清14-3-3蛋白的Dot-ELISA方法,对感染兔吡喹酮治疗前、后不同时间的配对血清中14-3-3蛋白含量的动态变化进行观察,并通过对一批血吸虫感染兔血清样本进行检测,以评价该方法的诊断价值。结果 6株抗日本血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体3F1、3F7、5C6、5D1、5G9、1G6的抗体亚类分别为IgG1、IgG2 a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1;腹水单克隆抗体效价分别为1∶6.4×105、1∶8.0×105、1∶6.4×105、1∶3.2×105、1∶4.8×105和1∶2.0×104;亲和常数分别为8.82×108、4.93×108、1.56×108、5.12×108、1.41×108mol/L和2.30×107mol/L;Dot-ELISA方法检测14-3-3蛋白的灵敏度分别为1、10、100、10、10 ng和100 ng。免疫印迹试验结果表明,6株单克隆抗体均可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原中的天然14-3-3蛋白特异性反应,而与大肠埃希菌和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法检测日本血吸虫感染兔治疗前、后不同时间点血清,发现随着感染时间的延长,兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐增加,吡喹酮治疗后兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐降低。采用此Dot-ELISA方法检测42份血吸虫感染兔血清,41份阳性,敏感性为97.6%;10份健康兔血清均为阴性,特异性为100%。结论 6株单克隆抗体均能有效识别天然的日本血吸虫信号蛋白14-3-3,初步证明以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法具有一定的日本血吸虫活动性感染诊断及潜在的疗效考核价值。     

抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法以重组表达纯化的日本血吸虫信号蛋白14-3-3为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对获得的单克隆抗体进行类和亚类、效价、浓度、纯度、亲和常数、特异性和检测灵敏度的测定与鉴定。结果共获得6株针对日本血吸虫信号蛋白14-3-3的单克隆抗体,分别为5G9、3F1、3F7、5C6、5D1和1G6,抗体类型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG1。对其中的单克隆抗体5G9分析显示,制备的腹水抗体效价为1∶1.28×105,亲和层析纯化后的浓度为5.3 mg/ml,纯度95%,亲和常数为5.1×107mol/L。免疫印迹试验结果表明,该单克隆抗体可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原特异性反应,而与大肠埃希菌、健康人血清和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。HRP标记的单克隆抗体5G9检测14-3-3蛋白的灵敏度为31.25 ng/ml。结论本研究获得了6株能稳定分泌抗日本血吸虫14-3-3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立新的日本血吸虫活动性感染检测方法奠定了良好的基础。     

日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原的融合表达及抗原性分析

目的 重组表达制备日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原（SjMP10）。 方法 根据日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10分子的读框序列设计合成1对引物，扩增SjMP10 DNA片段并克隆到表达载体pGEX-4T-3中。转化BL21(DE3)后，诱导表达谷胱甘肽转移酶-虫卵中毛蚴抗原10（GST-SjMP10）融合蛋白。采用洗脱法制备GST-SjMP10融合蛋白，应用免疫印迹法（Western blotting)和淋巴细胞增殖试验进行重组蛋白的抗原性分析。 结果 SjMP10基因克隆到表达质粒pGEX-4T-3后，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导能表达出Mr 39 000的GST-SjMP10融合蛋白，经电洗脱法纯化的上述重组融合蛋白可被血吸虫感染兔血清所识别，并能刺激血吸虫感染鼠脾淋巴细胞增殖。 结论 日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10融合表达获得成功。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察

目的　研究日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白1433(rSj1433)作为血吸虫病疫苗分子的潜能,并探讨rSj1433、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽(Mtb)激活的γδT细胞在抗血吸虫病中的作用。　方法　用SDSPAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj1433和rSjGST抗原,将两种抗原(分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂)分别免疫BALB/c小鼠后,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染6wk后,剖杀小鼠计算各组的减虫率。　结果　各组的减虫率为rSj1433+福氏佐剂组32.20%,rSj1433+rSjGST+福氏佐剂组31.10%,rSj1433+Mtb佐剂组27.96%,rSj1433+rSjGST+Mtb佐剂组26.00%,rSjGST+Mtb佐剂组27.10%;各组的减卵率分别为(按以上组序)50.40%、53.30%、51.10%、58.60%和51.30%。　结论　rSj1433具有一定的抗血吸虫潜能,有可能成为抗日本血吸虫疫苗,但未见rSj1433和rSjGST的协同作用;Mtb激活扩增的γδT细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。