腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素6在真核细胞中的表达效率

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率。方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素６（ＩＬ６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＩＬ６和ｐ３３５ＣＩＬ６。将它们瞬时转染ＣＯＳ７细胞后，利用ＩＬ６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ（ｖｉｒｕｓａｓｏｃｉａｔｅｄⅠａｎｄⅡＲＮＡ，ＶＡⅠａｎｄＶＡⅡ）和腺伴随病毒（ａｄｅｎｏａｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）的倒转末端重复序列（ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）能提高细胞因子在真核细胞中的表达     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素—6在真核细胞中 …

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素－６（ＩＬ－６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＬ－６和ｐ３３５ＣＩＬ－６。将它们瞬时转染ＣＯＳ－７细胞后,利用ＩＬ－６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ－６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ－６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ和腺伴随病毒的倒转末端重复序列     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人白细胞介素7（hIL-7）的真核表达载体。方法：从人脾脏组织的总RNA中，用RT－PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA，将其克隆于pMD18-T质粒中，并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒，转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS－PAGE电泳，并作考马斯亮蓝染色分析，western blot鉴定。结果：hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7（正义插入）的无隆表达重组蛋白，western blot证实此蛋白为IL－7。结论：成功构建了hIL-7的真核表达载体，为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。     

白细胞介素2和白细胞介素6在支气管哮喘发病中的诊断意义

支气管哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。成人发病率1%,儿童可达3%,因此及时诊断是早期防治的关键。为了探讨白细胞介素2(ＩＬ-2)和白细胞介素6(ＩＬ-6)在支气管哮喘发病中的作用,我们对26例哮喘患者的血清ＩＬ-2和ＩＬ-6进了测定,现报告如下。1　对象与方法11　对象　临床确诊的住院患者26例,其诊断标准参照1993年广州哮喘会议制定标准和1993年第三届全国小儿呼吸道学术会议制定的哮喘诊断标准。其中男18例,女8例。年龄3～40岁,平均28岁。病程1个月～30年,平均47年。选择年龄匹配的正常人22例为对照组。12　方法　入院…     

白细胞介素-18在肺纤维化大鼠肺组织中的表达

目的:观察白细胞介素-18(interlenkin,IL-18)在博莱霉素致大鼠肺纤维化模型中的表达,探讨其在肺纤维化发病机制中的作用.方法:雄性Wistar大鼠分为3组:博莱霉素模型组30只,气管内一次性注入博莱霉素A5 5 mg*kg-1,分别于第1、3、7、14、28天各处死6只;阿奇霉素治疗组12只,气管内注入博莱霉素后2 h开始于胃管内给阿奇霉素(80 mg*kg-1*d-1,每周3次)治疗,分别于第7、28天各处死6只;对照组6只,气管内及胃管内均给生理盐水,第7天处死.对HE染色病理结果进行计算机灰度扫描半定量分析,用RNA酶保护实验的方法检测IL-18 mRNA的表达,用免疫组织化学方法检测肺组织IL-18蛋白的表达.结果:IL-18在正常肺组织有一定水平的表达,自气管内注入博莱霉素第1天开始迅速升高,至第7天达高峰后逐渐下降,第28天时仍高于正常.经阿奇霉素有效抗炎治疗后,其表达明显下降.免疫组织化学显示活化的肺泡巨噬细胞和间质单核细胞是IL-18的主要来源,某些细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和纤维化严重区域的成纤维细胞也有表达.结论:IL-18是肺纤维化中重要的前炎症因子,不仅参与早期的肺损伤和炎症的维持、发展,也可能参与纤维化的形成.阿奇霉素可抑制IL-18在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.     

白细胞介素1和白细胞介素6在周围神经再生中的作用

目的：采用比较的方法，观察白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）在周围神经再生的作用。方法：选用SD大鼠40只，在右后肢坐骨神经形成1cm缺损，取同侧颈静脉桥接，注入不同的实验制剂，分为（1）IL-1和IL-6组；（2）雪旺氏细胞培养液组；（3）IL-1和IL-6封闭组；（4）培养液组作为对照。分别于术后1个月和3个月做电生理测定和组织学观察。结果：电生理测定和组织学观测的结果都显示，第一，二组明显优于第三，四组，结论：IL-1和IL-6有促进周围神经损伤后的再生作用。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达

目的克隆人IL-10 cDNA的全长序列，构建原核表达载体并诱导其表达。方法无菌条件下静脉采取正常人外周血10ml。加入等体积的生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心收集细胞，提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，进行RT—PCR，克隆出IL-10 cDNA，经双酶切后插入表达载体pMon中，用pMon—IL10重组体转染大肠杆菌DH5a。用萘啶酮酸诱导使重组人IL-10在大肠杆菌中表达，对表达产物进行SDS—PAGE电泳及Western—blot分析。结果人外周血单核细胞经ConA刺激后，IL—10转录水平增加，有利于IL-10 cDNA的克隆；克隆的IL-10 cDNA经测序证实与基因库报告的序列完全一致，插入pMon载体后经萘啶酮酸诱导能够在大肠杆菌DH5a表达；表达的蛋白质能与兔抗人IL—10特异性结合。结论人IL-10 cDNA被成功克隆并能够在大肠杆菌中表达。     

白细胞介素-10、白细胞介素-6在急性冠状动脉综合征中的临床意义

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)在急性冠状动脉综合征(ACS)的血清变化.方法采用ELISA法检测45例ACS患者,20例稳定性心绞痛(SAP)患者,20例对照者血清IL-10、IL-6水平.结果 ACS组血清-6水平较SAP组、对照组升高.ACS:(25.81±4.79)ng/L,SAP:(10.79±2.07)ng/L;(7.65±1.71)ng/L,均P<0.05;冠心病各组血清IL-10水平高于对照组,ACS:(18.23±3.42)ng/L,SAP:(15.20±4.98)ng/L,对照组:(9.40±3.09)ng/L,均P<0.05,ACS组与SAP组比较差异无统计学意义(P>0.05);而ACS组血清IL-6/IL-10比值高于SAP组及对照组,ACS:(1.69±0.53),SAP:(1.06±0.38),对照组:(0.92±0.41),均P<0.05.结论 ACS患者血清IL-6及血清IL-6/IL-10比值升高,ACS患者存在炎症因子及抗炎因子分泌失衡.     

重组小鼠白介素-2基因在真核细胞中的转染表达

目的：在构建重组真核表达载体pIRESneo2／mIL-2的基础上,建立能够持续稳定表达mIL-2的哺乳类工程细胞。方法：运用分子克隆技术,将由RT-PCR获得的mIL-2cDNA片断插入真核表达质粒pIRESneo2构建成mIL-2重组表达载体pIRESneo2／mIL-2。通过脂质体转染法将pIRESneo2／mIL-2导入C2C12细胞。转染后第30天,用Western blots检测mIL-2表达情况。结果：经DNA测序证明mIL-2cDNA片断插入方向和碱基组成顺序均准确无误,Western blots检测转染真核重组表达载体pIRESneo2／mIL-2的C2C12细胞系表达mIL-2。结论：利用pIRESneo2／mIL-2构建的真核表达载体在C2C12细胞系中能够持续稳定表达mIL-2。     

PSNAV2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 构建含人结缔组织生长因子（CTGF）的腺相关病毒（AAV）表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。     

携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建及其SK-N-SH细胞表达

目的构建携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒,检测其在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 PCR扩增alpha-突触核蛋白基因,产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha-突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,RT-PCR方法检测SK-N-SH细胞中alpha-突触核蛋白mRNA的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha-突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RT-PCR结果显示该表达载体转染SK-N-SH细胞后,细胞内alpha-突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高,MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SK-N-SH细胞内表达,且对细胞的存活率不产生任何影响,从而为进一步研究alpha-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。     

P16基因重组质粒的构建及其对人脑胶质瘤细胞的抑制作用

目的：探讨P16基因对人胶质瘤细胞的抑制作用,为胶质瘤致瘤机理的研究和基因治疗提供理论基础。方法：运用分子克隆技术构建重组人P16基因功体（pcDNA3-P16),通过脂质体介导法将P16cDNA转染到存在P16基因纯合缺失的人胶质瘤细胞系SHG－44。结果：PCR证实含P16cDNA质粒DNA已转入SHG－44细胞,Western blot显示有P16蛋白表达。细胞生长曲线显示转杂P16基因的SHG－44细胞（SHG－44－P16）生长明显受到抑制,基抑制率达84．27％。在软琼脂上克隆形成能力下降约6倍。细胞周期分析表明,处在G1期细胞由30．70％提高到66．21％。结论：野生型P16基因导入P16基因功能缺失的肿瘤细胞,能恢复其抑制肿瘤细胞生长的功能。     

GFP标记的重组腺病毒GDNF基因在脑缺血大鼠脑内的表达

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）标记的重组腺病毒胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因在脑缺血大鼠脑内的表达。方法：采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型,3d后用脑立体定位仪经侧脑室注射生理盐水或GDNF重组腺病毒液,注射前及注射后4d对大鼠进行神经功能损伤程度评分（NSS）。注射后4d麻醉处死大鼠,脑组织石蜡包埋。抗GFP免疫组织化学方法观察重组腺病毒GDNF基因在脑内的表达。结果：注射后4d,GDNF组与NS组相比,NSS评分显著降低;GDNF组,注射后4d,缺血侧纹状体内和梗死灶周围有大量GFP阳性细胞。结论：腺病毒介导的GDNF基因在脑缺血大鼠脑内能直接感染病灶周围神经细胞,表达GDNF蛋白,改善缺血后大鼠的神经功能状况。     

高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞c-myc和p21基因表达的影响

目的 :探讨高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞 c- myc和 p2 1基因表达的影响。方法 :体外培养的人腹膜间皮细胞经含 1.5 %、2 .5 %、4 .2 5 %葡萄糖的 M199培养基培养 2 4 h,以正常 M199培养基和含 4 .2 5 %甘露醇的 M199培养基为对照。应用半定量 RT- PCR检测 c- m yc、p2 1基因 m RNA表达。结果 :2 .5 %葡萄糖组、4 .2 5 %葡萄糖组间皮细胞 c- myc和 p2 1m RNA的表达量显著高于 1.5 %葡萄糖组、M199对照组及 4 .2 5 %甘露醇渗透压对照组 (P<0 .0 5 ) ;而 1.5 %葡萄糖组、M199对照组及 4 .2 5 %甘露醇渗透压对照组间间皮细胞 c- myc和 p2 1m RNA的表达量无显著差异 (P>0 .0 5 ) ,且葡萄糖浓度越高 ,c- myc和 p2 1m RNA表达量越高 (r=0 .96 8,0 .96 7,P<0 .0 1)。结论 :高浓度葡萄糖能上调 C- myc和 P2 1m RNA基因表达 ,这种作用与葡萄糖浓度呈正相关。     

rhEPO对光损伤诱导的RPE细胞Bcl-2表达影响

目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对光损伤诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞Bcl-2表达的影响及其作用机制.方法 取成人ARPE-19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型,采用酶联免疫吸附实验和免疫组织化学方法检测不同浓度rhEPO干预治疗前后RPE细胞Bcl-2表达的变化;并添加特异性Jak2激酶抑制剂AG490,检测RPE细胞Bcl-2表达的变化.结果 rhEPO可明显增强RPE细胞光损伤后Bcl-2的表达,与光损伤模型组相比较,rhEPO各药物干预组细胞Bcl-2表达均增强,差异有显著意义(F=18.756,q=36.028～44.285,P<0.01),以40 kU/L rhEPO组作用最明显.而加入AG490后,rhEPO对Bcl-2的上调作用被明显阻断(q=42.171,P<0.01).结论 rhEPO可能是通过增强Bcl-2的表达而抑制光损伤诱导的人RPE细胞的凋亡,rhEP0上调Bcl-2的表达可能是通过Jak2 PIK3/PKB途径实现的.     

HBV前C/C基因与绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的 :构建含HBV前C C基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体 ,并在真核细胞中表达。方法 :用PCR法扩增含 1.3倍HBVayw型全基因组真核表达载体pHBV1.3的前C C基因片断 ,应用含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒构建融合表达载体 ,采用脂质体介导方法将其转染到HEK2 93细胞 ,并用荧光显微镜及ELISA法检测融合蛋白的表达。结果 :经PCR及酶切鉴定 ,证实成功构建了含HBV前C C基因的真核表达重组体pEGFP -HB VC ,显微镜下观察及ELISA法证实在HEK2 93细胞中表达了相应融合蛋白。结论 :构建的重组表达载体能在真核细胞中表达目的蛋白与GFP的双功能融合蛋白 ,适合于针对HBV前C C区的相关研究。     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.