长链非编码RNA HCG18对肝癌细胞生物学活性的影响

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)人类白细胞抗原复合体(HCG18)在肝癌细胞中的表达及作用。方法选取23对来自郑州大学第一附属医院的肝癌、癌旁组织和购自中国科学院细胞库的人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H和正常肝细胞LO2作为研究对象。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝癌和癌旁组织及肝癌细胞系和正常肝细胞中HCG18的表达。采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默MHCC97H和Hep3B细胞中HCG18的表达,同时分别设置阴性对照组,采用si-NC对其进行转染。采用克隆实验、Transwell体外迁移实验、流式细胞周期和凋亡实验检测细胞增殖能力、侵袭能力、细胞周期和凋亡率。结果肝癌组织中HCG18表达量较癌旁组织高,差异有统计学意义(P<0.001),肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H中HCG18表达量均较正常肝细胞LO2高,差异有统计学意义(均P<0.01)。转染HCG18 siRNA后,肝癌细胞MHCC97H和Hep3B的增殖、侵袭能力均低于转染si-NC的阴性对照组。HCG18 siRNA转染的MHCC97H和Hep3B细胞被阻滞在G_0/G_1期,凋亡率高于转染si-NC的阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 HCG18在肝癌细胞中高表达,其可促进肝癌细胞的增殖和侵袭,有望成为肝癌治疗的新靶点。     

反义IGF-Ⅰ寡核苷酸转染对人肝癌细胞增生及凋亡的影响

为研究胰岛素样生长因子 I(IGF I)反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞增生、分化及凋亡的影响 ,探讨寡核苷酸转染治疗肝癌的可行性 ,利用反义核酸技术 ,合成针对IGF I的寡核苷酸片段 ,利用脂质体包裹反义IGF I寡核苷酸片段瞬时转染人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞 ,MTT法检测细胞增生 ;放免法检测培养细胞上清中AFP、CEA的分泌量 ;采用末端标记 (Tunel)法检测细胞凋亡的变化。结果发现转染反义IGF I寡核苷酸可使人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞增生下降 ,AFP、CEA表达降低 ,凋亡细胞数量增多。反义IGF I寡核苷酸转染人肝癌细胞系BEL 74 0 2细胞可以降低细胞增生、减少细胞去分化并诱导肝癌细胞凋亡     

金雀异黄素下调Gli1表达抑制MHCC97H细胞系肝癌干细胞样细胞侵袭

目的:研究金雀异黄素能否和如何抑制肝细胞癌MHCC97H细胞系肝癌干细胞样细胞侵袭。方法:干细胞条件培养基悬浮培养MHCC97H细胞系球形成细胞,作为肝癌干细胞样细胞。不同浓度金雀异黄素处理后,Transwell小室侵袭试验检测体外细胞侵袭能力;Western blot分析Gli1和Snail1蛋白表达。结果:干细胞条件培养基悬浮培养MHCC97H细胞能形成肿瘤球。金雀异黄素(5、10和20μM)作用第3代球形成细胞即肝癌干细胞样细胞72 h降低肿瘤球形成率和细胞侵袭率;呈浓度依赖性。金雀异黄素(5、10和20μM)孵育肝癌干细胞样细胞24 h下调Gli1和Snail1蛋白表达。结论:金雀异黄素可能通过调控Gli1抑制Snail1蛋白表达抑制肝癌干细胞样细胞侵袭。     

JWA抑制人肝癌细胞的黏附和迁移侵袭潜能

探讨JWA蛋白在人肝癌细胞黏附和迁移侵袭过程中的作用?方法:应用小干扰RNA下调低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L中JWA蛋白表达水平,MTT法检测MHCC97L增殖;应用细胞小室检测MHCC97L在JWA不同蛋白水平时的迁移及侵袭潜能变化;黏附试验检测MHCC97L细胞黏附能力变化?结果:研究发现人肝癌细胞株MHCC97L中的JWA表达水平下降后,肝癌细胞迁移及侵袭能力明显增强,细胞对细胞外基质纤维连接蛋白的黏附力增加?结论:RNA干扰JWA引起肝癌细胞的JWA蛋白表达水平下降,导致肝癌细胞的黏附?迁移及侵袭能力增强,结果提示JWA可能抑制人肝癌细胞侵袭和转移?     

VEGF-C在宫颈癌细胞的表达及其与细胞黏附和侵袭的关系

目的 VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其与细胞黏附和侵袭等转移相关生物学行为的关系。方法 采用脂质体转染技术将VEGF-C反义寡核苷酸转染人宫颈癌HeLa细胞,通过黏附实验、Transwell小室,检测转染后细胞黏附和侵袭能力的变化。结果 脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸,转染了VEGF-C反义寡核苷酸的HeLa细胞,能抑制其对细胞外基质的黏附能力;转染后48 h对细胞外基质FN、Matrigel的黏附率较正义组和未转染组明显降低,统计分析差异具有显著性(P＜0.05);Transwell小室实验,计数转染VEGF-C反义寡核苷酸的细胞穿过滤膜的数量,在24 h和48 h较正义组和对照组都减少(P＜0.05)。结论 VEGF-C可影响人宫颈癌HeLa细胞的黏附、侵袭能力等生物学行为。这可能是VEGF-C促进肿瘤细胞淋巴转移的机制之一。     

NDRG2通过影响CD24调控肝癌细胞黏附能力的机制研究

目的 阐明NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene 2)在肝癌细胞中对CD24的调控及其对肝癌细胞黏附能力的影响. 方法 real-time PCR检测低转移性的肝癌细胞系Huh7、高转移性肝癌细胞系MHCC97H及人正常肝细胞系L-02中NDRG2和CD24的表达;通过腺病毒上调MHCC97H细胞中NDRG2的表达,或利用siRNA下调Huh7细胞中NDRG2的表达,检测CD24基因变化.黏附实验检测改变NDRG2表达水平后对MHCC97H及Huh7细胞黏附能力的影响. 结果 MHCC97H细胞中NDRG2基因表达水平低于Huh7细胞,而CD24的表达水平高于Huh7细胞;在MHCC97H细胞中通过腺病毒载体上调NDRG2可以抑制CD24的表达并抑制其黏附能力,而在Huh7细胞中利用siRNA下调NDRG2的表达可以提高CD24的水平及细胞的黏附能力. 结论 NDRG2通过影响CD24参与调控肝癌细胞的黏附能力.     

SYK基因启动子甲基化对肝细胞癌侵袭力的影响

目的 探讨肝癌细胞中SYK基因启动子甲基化的状态及其对肝细胞癌侵袭力的影响.方法 分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SYK基因在肝(癌)细胞系L02、HepG2、MHCC97H、MHCC97L中的表达和甲基化状态;对SYK基因甲基化阳性的MHCC97H和HepG2细胞株利用TRANSWELL小室检测去甲基化药物5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后肝癌细胞穿膜的细胞数,作为评价肝癌细胞体外浸润能力的指标.结果 L02、MHCC97L表达SYK mRNA,MHCC97H、HepG2不表达SYK mRNA;L02、MHCC97L细胞SYK基因甲基化阴性,MHCC97H、HepG2细胞SYK基因甲基化阳性.甲基化阳性的MHCC97H、HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,SYK基因异常甲基化状态得到逆转,体外浸润能力显著下降(P＜0.001).结论 肝癌细胞中SYK基因的表达与启动子甲基化有关,SYK基因可抑制肝癌细胞的体外浸润能力.     

同源异型盒基因HOXA5抑制肝癌的侵袭和迁移通过调控UBC9的表达

目的:检测人肝癌及癌旁组织中HOXA5基因的表达情况,观察稳定高表达HOXA5基因的肝癌细胞MHCC97H迁移和侵袭能力的变化,探讨HOXA5调控肝癌侵袭迁移的机制,为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶点。方法:通过实时定量PCR(qRT-PCR)、Western blot以及免疫组织化学等技术检测肝癌及癌旁组织中HOXA5基因的表达。构建稳定高表达HOXA5的肝癌细胞MHCC97H,利用划痕和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化。应用CHIP-Seq筛选出HOXA5潜在的靶基因,在稳定高表达HOXA5基因细胞中应用qRT-PCR、Western blot验证HOXA5与靶基因的关系。结果:新鲜的肝癌组织以及相对应的癌旁组织中,免疫组织化学显示相比于癌旁组织的表达情况,肝癌组织中HOXA5的表达低于癌旁;qRT-PCR、Western blot检测发现相对于癌旁组织,肝癌组织中HOXA5的表达水平显著下调。过表达了HOXA5基因的MHCC97H细胞的侵袭能力下降。CHIP-Seq的结果发现,HOXA5结合在UBC9的上游启动子区域。在稳定高表达HOXA5的MHCC97H细胞中,UBC9的mRNA和蛋白表达均下调。当在稳定高表达HOXA5的同时过表达UBC9时,肝癌细胞的侵袭和迁移能力部分回复。结论:在肝癌组织中HOXA5的表达下调;UBC9介导了HOXA5抑制肝癌细胞侵袭迁移的作用,这为进一步阐明肝癌发生侵袭转移过程中的分子机制提供一个新的思路,为精准治疗肝癌提供一个可能的靶点。     

KAI1基因对肝癌细胞侵袭、转移的影响及其分子机制

目的研究肿瘤转移抑制基因KAI1对肝癌细胞侵袭、转移的影响及其分子机制,为肝癌的基因治疗提供理论和实验依据.方法用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,DOTAP脂质体法将其分别转入高转移潜能的人MHCC97-H肝癌细胞,以限制性酶切、PCR、Western blot及免疫组化鉴定基因重组及转染是否成功.电镜观察细胞超微形态变化,流式细胞仪检测细胞周期分布,细胞生长曲线和平板法集落形成试验观察细胞生长和集落形成能力,Boyden Chamber试验观察细胞侵袭能力,微管吸吮技术测定细胞的粘弹性和粘附力.BALB/CA 4～6周龄雄性裸鼠80只,随机分正义组、反义组、亲本细胞组及空载体组进行皮下(n=40)和原位肝(n=40)种植试验,观察体内的成瘤性、侵袭性及远处转移能力,免疫组化研究癌转移灶AFP和肿瘤组织细胞外基质(ECM)及粘附分子的表达状况.结果(1)成功构建了KAI1正、反义基因真核表达质粒,并将其分别转入MHCC97-H人肝癌细胞;(2)发现转入KAI1基因后可导致肝癌MHCC97-H细胞的一些细胞器数量和形态的变化;(3)KAI1基因对肝癌MHCC97-H细胞的体内外生长、细胞周期及体内成瘤性无明显影响;(4)反义KAI1基因可使MHCC97-H细胞的克隆形成能力增强、对体内外肝癌细胞的侵袭和转移有促进作用;(5)KAI1基因表达上调能使MHCC97-H细胞的体内外侵袭能力降低;(6)KAI1基因抑制肝癌侵袭和转移的机制可能与细胞粘弹性增加、ECM表达上调、粘附分子表达下调及粘附力下降等变化有关.结论KAI1基因在肝癌的侵袭转移过程中发挥着重要作用,上调KAI1基因表达能明显降低肝癌细胞的侵袭和转移能力.     

survivin反义寡核苷酸对肝癌耐药细胞的作用及与化疗的关系

目的研究survivin反义寡核苷酸对人肝癌耐药细胞株的增殖和凋亡情况,以及对阿霉素化疗敏感性的影响。方法将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM分为脂质体转染组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染组、正义寡核苷酸转染 阿霉素组、反义寡核苷酸转染组、反义寡核苷酸转染 阿霉素组共6组。MTT法检测细胞相对存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡率变化,RT-PCR和Westernblot印迹法检测细胞survivinmRNA和蛋白表达。结果survivin-ASODN作用后的人肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM的细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。survivinmRNA和survivin蛋白表达:脂质体转染对照组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染对照组、正义寡核苷酸转染对照 阿霉素组之间survivin蛋白表达无明显差异(P>0.05)。400ng/mlsurvivingASODN组和400ng/mlASODN 阿霉素组survivinmRNA较其他4组显著降低(P<0.05),但其两组之间表达无明显差异(P>0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能降低肝癌耐药细胞survivin表达,增强人肝癌耐药细胞对阿霉素的化疗敏感性。     

体外RNA干扰下调ezrin表达对肝癌细胞生长和运动能力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对肝癌生长和运动转移能力的影响。方法选取4株肝癌细胞系(SF/SMMC7721、MHCC97-H、MHCC-1和HepG2)作为研究材料,针对ezrin基因设计小干扰RNA(siRNA)并通过脂质体转染入细胞。分别通过荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹验证siRNA对ezrin在基因和蛋白水平的下调及下调作用随转染时间的变化。根据Western印迹的结果选取ezrin蛋白表达最低的时间点检测干扰后肝癌细胞生物学行为的改变。运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞周期;电子显微镜观察细胞伪足的形态和数量改变;transwell实验检测肝癌细胞运动和转移能力的变化。结果荧光实时定量PCR和Western印迹显示ezrin siRNA对ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用。下调ezrin蛋白可显著减慢4株肝癌细胞的生长速度,处于分裂期的肝癌细胞比例明显下降(SF/SMMC7721:28·07%下降到21·53%;MHCC97-H:24·94%下降到13·92%;MHCC-1:19·30%下降到13·2%;HepG2:7·73%下降到4·24%)。肿瘤细胞的运动侵袭能力下降,细胞伪足变短,且伪足的形成数量显著减少(SF/SMMC7721:20·8个/细胞±3·0个/细胞与13·2个/细胞±2·4个/细胞,P<0·05;MHCC97-H:18·4个/细胞±2·7个/细胞与14·0个/细胞±2·9个/细胞,P<0·01;MHCC-1:22·6个/细胞±3·5个/细胞与13·3个/细胞±1·9个/细胞,P<0·01;HepG2:31·0个/细胞±2·9个/细胞与17·8个/细胞±2·3个/细胞,P<0·01;每株计数5个细胞)。穿过人工基底膜的细胞数量也明显减少(SF/SMMC7721:49·9个±7·7个与31·9±5·2个,P<0·05;MHCC97-H:58·5个±4·2个与33·0个±3·3个,P<0·01;MHCC-1:57·6个±6·1个与28·3个±3·4个,P<0·01;HepG2:37·3个±3·0个与25·3个±2·3个,P<0·01;每株8个视野)。结论ezrin在肝癌生长和侵袭转移过程中发挥重要的作用,有可能成为抑制肝癌复发转移的关键分子。     

SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株的表达

目的研究SATB1在不同侵袭潜能的人肝癌细胞株表达状况。方法分别用荧光定量PCR,RT-PCR,Western blotting及免
疫荧光方法,检测人永生化肝细胞株HL-7702及肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3 中SATB1
的表达。结果相对于HL-7702,SATB1 mRNA在其余5 种肝癌细胞株中都有较高程度的表达,其中高侵袭性HCCLM3、
MHCC97H 表达最高,MHCC97L 次之,SMMC-7721、HepG2 最低（P<0.001）;Western blotting 分析HepG2、SMMC-7721、
MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株的蛋白相对表达量分别为0.271±0.002;0.351±0.023;0.621±0.026;0.878±0.026;
1.236±0.006,高侵袭性HCCLM3相当于HepG2的4.6倍（P<0.001）;免疫荧光显示SATB1在5种肝癌细胞株的胞浆和胞核内均
有分布,高侵袭性细胞株HCCLM3、MHCC97H表现强阳性染色。结论SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株中的表达有差异,
与肝癌转移密切相关。     

C75对肝癌细胞侵袭转移的影响及其机制

目的 观察C75对肝癌MHCC97H细胞侵袭转移的作用,并探讨其作用机制. 方法 通过划痕实验和Transwell小室检测C75对肝癌MHCC97H细胞迁徙和侵袭的影响.采用Western blot的方法探讨C75对MMP-2、MMP-9及其抑制物TIMP-2、TIMP-1表达的影响.采用明胶酶谱的方法检测C75对MMP-2和MMP-9蛋白酶活性的影响. 结果 C75能够明显抑制MHCC97H细胞迁徙能力和侵袭能力;C75能够抑制MHCC97H细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平及酶活性,且能够增高TIMP-1和TIMP-2的表达水平. 结论 C75能够抑制肝癌细胞MHCC97H的迁徙和侵袭能力.这种抑制作用可能与其对MMP/TIMP的平衡调节相关.     

凹陷蛋白-1基因在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及其意义

目的 探讨候选抑癌基因凹陷蛋白(Caveolin)-1在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与HCC侵袭、转移的关系.方法 对123例HCC标本以及MHCC-97L和MHCC-97H肝癌细胞株进行实时荧光PCR法、免疫组化法及Western印迹法检测Caveolin-1 mRNA及蛋白表达,分析其表达与肿瘤侵袭、转移性间的关系.结果 Caveolin-1在肝癌组织中较癌旁组织表达明显下调(P<0.05);HCC 中的表达水平与大/小肝癌(≥5 em或<5 cm)、AFP表达水平、有无大血管侵袭、肿瘤单发或多发及pTNM分期5个因素均呈显著负相关(P<0.05),其在MHCC-97H细胞株中的表达显著低于MHCC-97L(P=0.000);Caveolin-1与HBx表达显著负相关(P=0.044).结论 Caveolin-1表达与HCC侵袭转移密切相关,其表达下调,预示HCC的预后不良;有可能存在HBx蛋白下调Caveolin-1表达的机制.     

miR-21通过下调PTEN表达促进肝癌细胞增殖、侵袭及迁移

目的 探讨miR-21在肝癌组织中的表达、临床意义及可能的分子机制。方法 实时定量PCR检测miR-21在肝癌及癌旁组织中的表达,MTT法检测MHCC-97H细胞的增殖,Transwell实验检测MHCC-97H细胞的侵袭及迁移,Westernblot法检测miR-21下游潜在靶点PTEN的表达。结果 miR-21在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织;肝癌组织中miR-21高表达与肿瘤大小、TNM分期、门静脉侵犯及Edmondson分级显著相关;高表达miR-21患者3年生存率明显低于低表达组;miR-21可显著促进MHCC-97H细胞的增殖、侵袭及迁移,并下调PTEN的蛋白水平。结论 miR-21在肝癌组织中表达显著上调并与肝癌恶性临床病理特征有关,miR-21促进肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用可能与下调PTEN表达有关。     

靶向干扰CXCR7基因表达对肝癌(HCC)细胞增殖及凋亡的影响

 目的  探讨CXCR7基因在不同肝癌细胞系及肝癌组织中的表达情况,并研究靶向抑制CXCR7基因表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法  应用Western blot检测不同肝癌细胞系及10例肝癌组织中CXCR7蛋白的表达水平。采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默HCCLM3与MHCC97L细胞中CXCR7基因的表达,分别采用Western Blot和qRT PCR检测shRNA的靶向沉默效果。通过CCK-8增殖实验与Annexin V-FITC/PI细胞双染色研究CXCR7抑制对HCCLM3与MHCC97L增殖及凋亡的影响。结果  CXCR7表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关,肝癌组织中CXCR7表达水平较癌旁显著升高。实验成功构建了9个慢病毒表达载体,其中CXCR7 shRNA 566序列干扰效率最高。增殖实验显示干扰表达组细胞生长速度受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪分析显示干扰CXCR7表达可诱导细胞凋亡的发生。结论  CXCR7表达水平与肝癌恶性程度呈正相关,靶向干扰CXCR7表达可抑制细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡。     

miR-149-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的分析miR-149-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床意义。方法应用qRT-PCR方法检测40对HCC癌组织和癌旁肝组织中miR-149-5p的表达,并分析miR-149-5p的表达与肝癌患者临床病理之间的关系,进一步将以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)为报告基因的miR-149-5p慢病毒(LV-miR-149-5p)感染MHCC97-H肝癌细胞,以过表达miR-149-5p,采用MTT检测感染后细胞增殖的变化,采用流式细胞仪测定感染后细胞周期的变化,并采用Transwell侵袭实验检测感染后细胞的体外侵袭能力的变化。结果 qRT-PCR结果提示miR-149-5p在HCC癌组织中的相对含量(5.522±1.104)低于癌旁肝组织(9.279±1.594)(P<0.05),统计分析表明miR-149-5p在癌和癌旁肝组织中相对含量的比值与AFP含量负相关(P<0.05)。体外实验证实,miR-149-5p过表达不能影响细胞周期但能抑制细胞增殖(P<0.05),而在Transwell侵袭实验中,LV-miR-149-5p感染MHCC97-H细胞后,对照细胞组透膜细胞数为(86.3±11.8)/视野,对照慢病毒组透膜细胞数为(83.7±4.0)/视野,LV-miR-149-5p组透膜细胞数为(50.6±3.4)/视野,实验组细胞侵袭能力较对照组细胞显著降低(P<0.05)。结论 miR-149-5p的过表达可抑制MHCC97-H细胞的增殖和侵袭,因此,miR-149-5p可作为一种抑癌基因在HCC的诊断及治疗中发挥作用。