乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞癌生长因子激活作用的研究

目的研究乙型肝炎病毒Ｘ（hepatitisBvirus,HBx）蛋白对生长因子激活作用,探讨HBx蛋白对肝细胞癌生长的影响。方法构建Ｘ基因真核表达载体,转染入HepG2细胞后,细胞组织化学和免疫印迹法检测胰岛素样生长因子－Ⅰ受体（insulin-likegrowthfactorⅠreceptor,IGF-ⅠR）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达。结果转染HBx基因HepG2细胞（X细胞）IGF-ⅠR表达阳性率为84%±3%,转染空载体对照细胞（X0细胞）为26%±4%;免疫印迹法检测Ｘ细胞有明显条带。VEGF表达Ｘ细胞阳性率为83%±5%,X0细胞为28%±6%,差异有非常显著意义;Ｘ细胞IGF-ⅠR表达增高近1.5倍。结论HBx蛋白可同时激活IGF-ⅠR和VEGF,在肿瘤恶性生长、转移中起有重要作用。     

Fas、FasL在慢性乙型肝炎患者肝细胞和外周血淋巴细胞上的表达

探讨慢性乙型肝炎患者肝细胞及外周血淋巴细胞上Fas、FasL的表达与乙型肝炎病毒（HBV）复制水平及肝组织炎症程度的关系。对30例慢性乙型肝炎患者进行肝穿刺肝组织病理检查及免疫组化SP法检测肝细胞中Fas、FasL表达强度。并采用单克隆抗体经流式细胞仪检测外周血淋巴细胞上Fas、FasL表达阳性百分率;同时,采用荧光实时标记法测定血清中病毒复制指标HBV DNA水平;采用Beckman全自动生化分析仪检测肝功能并研究其相关性。慢性乙型肝炎患者肝细胞中Fas、FasL表达强度随肝组织炎症活动度加重而增强（P均〈0．001）,与白蛋白及丙氨酸转移酶（ALT）呈负相关（P〈0．005,P〈0．001）,与球蛋白、总胆红质无明显相关性（P均〉0．05）。外周血淋巴细胞上Fas、FasL的表达阳性率与血清中肝炎病毒复制指标HBV DNA水平呈正相关;与慢性肝炎分度无明显的相关性。乙型肝炎病毒感染可诱导肝细胞及外周血淋巴细胞上Fas、FasL的表达。肝细胞Fas、FasL的表达随炎症活动度加重而表达增强,但其介导的凋亡并不引起肝细胞炎症损伤即ALT活性并不升高,相反减少;同时在某种程度上影响白蛋白的合成。提示Fas—FasL介导的肝细胞凋亡是以非细胞损伤方式参与慢性乙型肝炎的发病过程。同时,随血清HBV DNA水平增高,外周血淋巴细胞上Fas、FasL的表达亦增强,淋巴细胞的凋亡因而增多,是导致乙型肝炎慢性化的原因之一。由此可见,Fas、FasL介导的凋亡参与了慢性乙型肝炎的发病机制,且在慢性乙型肝炎的发生发展中起重要作用。     

乙型肝炎病毒x影响肝细胞增殖与凋亡的初步研究

目的 观察乙型肝炎病毒x(HBx)导入正常肝细胞后对细胞周期及凋亡的影响,探讨HBx致肝细胞癌的发生机制.方法 应用脂质体转染重组质粒pcDNA3.1( )/v5-hisB-HBx后,G418筛选获得阳性克隆L02/HBx,分别用RT-PCR和Western blot鉴定其HBx mRNA与蛋白的表达.噻唑蓝比色法(MTT)及细胞生长曲线观察细胞增殖情况,流式细胞术分析其细胞周期特征与凋亡率.结果 构建的L02/HBx细胞中可稳定表达HBx mRNA及蛋白.与对照组比较,L02/HBx细胞增殖速度明显加快(P＜0.05);其G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例显著增加,凋亡率明显降低(P＜0.05).结论 成功构建稳定表达HBx的转基因细胞株L02/HBx,初步显示HBx可促进肝细胞增殖,抑制细胞凋亡,从而加速细胞周期进程,可能参与肝细胞的恶性转化.     

乙型肝炎病毒X基因与肝细胞凋亡

乙型肝炎病毒X基因(HBX)对病毒在体内生成必不可少,HBX广泛参与病毒复制、反式激活作用、肝细胞生长、凋亡、癌变过程,成为当前研究的热点课题,本文对HBX与肝细胞凋亡方面的进展作一综述.     

乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响

目的 探讨HBV复制过程中HBx蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响. 方法 采用原代小鼠肝细胞为研究系统,用野生型HBV质粒(pHBV)和HBx蛋白表达缺失的HBV质粒(pHBV△X)分别转染细胞.Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、cyclin A及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16 (p16)、p21的表达水平；实时荧光定量PCR和Southern blot检测HBVDNA复制水平.两组之间比较用两样本均数t检验,多样本均数间的比较用方差分析及q检验. 结果 新分离肝细胞和原代培养24、48、72 h肝细胞的细胞周期蛋白表达水平无明显差异；转染48 h后,pHBV组细胞与pHBV△X组细胞周期蛋白条带灰度值相比,前者cyclin D1、p21、cyclin E表达量较高,p16的表达量较低,统计量t值分别为15.713,22.897,14.680,-19.584,P值均＜0.05.培养72 h后提取HBV DNA,Southem blot检测HBV DNA复制中间体松散环状DNA、双链线性DNA、单链DNA的水平,经条带灰度扫描,pHBV组的水平(分别为3288.336±448.011、6458.318±182.163、2760.613±393.561)明显高于pHBV△X组(分别为515.721±62.530、2122.228±28.347、1632.013±207.021)及空白对照组,P值均＜0.05；实时荧光定量PCR检测HBV DNA复制水平,pHBV组[每个细胞(987.50±47.80)拷贝]也明显高于pHBV△X组[每个细胞(303.67±33.94)拷贝],t=20.203,P＜0.05.结论 HBx蛋白能通过调节细胞周期中各蛋白的表达,使细胞由静止期(G0)进入DNA合成前期(G1)并停滞于G1期,从而促进HBV的复制.     

乙型肝炎病毒X基因突变与肝细胞癌

原发性肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,慢性HBV感染是导致肝细胞癌的主要病因。HBV诱发肝细胞癌的确切机制仍不十分清楚。目前在HBV相关肝细胞癌病人血清和肝癌组织中发现了许多HBV X基因突变体,一些与肝细胞癌发生发展密切相关。本文主要就HBV X基因突变与肝细胞癌研究进展进行综述。     

慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中FasL的表达

Ｆａｓ(ＣＤ95 )和ＦａｓＬ(ＣＤ95Ｌ)是近年来发现的一对介导细胞凋亡的细胞表面分子 ,在慢性乙型肝炎 (ＣＨＢ)患者的肝脏浸润淋巴细胞中可以检出ＦａｓＬ。一般认为 ,ＦａｓＬ的表达与肝脏炎症活动程度呈正相关 ,即肝脏的炎症活动性越强 ,ＦａｓＬ表达亦越强[1] 。我们采用流式细胞仪检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞中ＦａｓＬ表达阳性细胞的百分率 ,以期为肝病的预后判断及指导治疗提供一个客观而简便快速的检测方法。材料及方法一、研究对象慢性乙型肝炎病例均选自第二军医大学长征医院1998年 5月至 1999年 4月的住院患者 ,共 5 2…     

稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株的构建

目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒x基因（HBVx）的正常人肝细胞株。方法用PCR法扩增含EcoRI和HindⅢ酶切位点的x基因序列,构建HBVx基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBVx,转化大肠杆菌DHSct,筛选阳性克隆并对其进行双酶切和测序鉴定;用脂质体转染法将HBVx基因导入Chang细胞系,G418筛选,RT-PCR和Westernblot鉴定。结果x基因亚克隆入pcDNA3．1（＋）,含有完整的x基因片段,转染后Chang细胞有HBVxmRNA表达,Chang／HBVx有HBVx蛋白的表达。结论构建了稳定表达HBVx基因的肝细胞株Chang／HBVx。     

乙型肝炎病毒X基因转染人肝细胞致裸鼠的成瘤实验

目的 拟在裸鼠体内证实HBV X基因能否转化人肝细胞形成移植瘤.方法 利用高表达HBx基因的pCMVX/QSG7701细胞株作为实验组,以表达空白质粒的pRcCMV2/QSG7701细胞株和QSG7701细胞株为对照组接种于裸鼠皮下,观察裸鼠能否成瘤.HE染色、显微镜检查研究移植瘤的组织形态学特征.成瘤率的比较采用Fisher's精确检验.结果 接种pCMVX/QSG7701细胞株的所有6只裸鼠在第2周开始均出现移植瘤生长,周围器官和组织未发现转移灶.对照组至接种后第35天无移植瘤生长(X2-16.505,P＜0.01).HE染色证实移植瘤为肝细胞痛组织.结论 HBV X基因表达可以直接导致肝细胞癌变.     

稳定表达乙型肝炎病毒X和MicroRNA-21基因肝细胞株的构建方法研究

目的探讨稳定表达乙型肝炎病毒X(HBVX)和MicroRNA-21基因肝细胞株的构建方法。方法应用LE培养基对大鼠肝细胞株进行培养,将pcDNA 3.1-HBVX质粒中的HBVX序列作为实验模板,采用PCR法对获得的目的基因HBVX片段进行扩增,构建稳定表达的HBVX和MicroRNA-21基因肝细胞株。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察HBVX基因克隆结果,鉴定pcDNA 3.1(+)/HBVX重组质粒和MicroRNA-21质粒。结果 PCR产物HBVX基因片段中存在全部HBVX基因编码序列;RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后可见长度为300 bp的MicroRNA-21前体片段。结论本研究成功构建了稳定表达HBVX和MicroRNA-21基因肝细胞株,为临床进行深入研究提供了实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因的原核表达及血清抗HBx抗体的检测

目的 应用表达蛋白检测乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体水平并探讨其临床意义。方法 通过PCR扩增获得HBVX基因，与原核表达载体Pet32a＋连接构建PET32a-HBX原核表达载体，转化E．coli BL21表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后，应用重组蛋白HBx建立检测血清中抗-HBx抗体的间接ELISA方法，分别检测正常人组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组患者血清中的抗-HBx抗体。结果 获得具有免疫原性的HBx融合蛋白；ELISA检测表明，慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体的水平均高于急性肝炎组，差异具有显著性；在三组之问，慢性肝炎组高于肝硬化组和肝细胞癌组，差异具有显著性，肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体水平无显著性差异。结论 HBV患者血清中抗-HBX抗体是乙型肝炎病毒感染的一种特异性抗体，是HBV感染的血清学指标之一，可以反映乙型肝炎肝炎患者病情的变化。     

Fas抗原在乙型病毒性肝炎肝组织中表达的研究

目的 检测乙型病毒性肝炎肝组织中Fas抗原,以探讨Fas抗原的表达与肝细胞损伤之间的关系。方法 以免抗—Fas多克隆抗体,采用免疫组织化学技术检测33例急性重型肝炎,23例慢性迁延型肝炎,32例慢性活动性肝炎,21例活动性肝硬化和13例慢性重型肝炎肝组织中Fas抗原表达情况。结果 上述5组分型中Fas抗原检出率分别为90.9％、43.5％、78.1％、85.7％和92.3％。急性重型肝炎Fas抗原分布于大片坏死区残留肝细胞内,慢性肝炎和活动性肝硬化Fas抗原阳性细胞分布于碎屑状坏死灶周围或假小叶周边部。肝组织病理改变越重,Fas表达越强。结论 Fas抗原的表达与肝细胞损伤密切相关。     

乙型肝炎病毒X抗原表达与肝细胞凋亡的相关性

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)在HBV感染相关性肝病患者病情进展和癌变过程中的作用. 方法 用免疫组织化学方法检测38例HBV慢性感染者(HBV携带者14例及慢性乙型肝炎患者24例)、20例乙型肝炎肝硬化(LC)和20例HBV相关性肝细胞癌(HCC)患者肝组织中HBxAg、Fas及其配体(FasL)的表达,分析HBxAg与Fas、FasL表达的相关性及其与患者病毒学指标和肝脏病理学改变的关系.肝脏炎症分级及纤维化分期按照Knodell标准.计数资料用x2检验及Fisher精确概率法,多个样本间的两两比较用x2分割法,等级资料用秩和检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析. 结果 HBV慢性感染者、LC及HCC患者肝组织中HBxAg阳性率分别为71.1％、60.0％、65.0％,差异无统计学意义(x2=0.754,P＞0.05).肝细胞中Fas和FasL阳性率分别为28.9％、20.0％、5.0％和36.8％、50.0％、60.0％,各组间差异均无统计学意义(x2值分别为4.667和2.988,P值均＞0.05).三组患者肝组织淋巴细胞Fas表达的阳性率分别为68.4％、60.0％和90.0％,其中,肝癌患者的表达强度显著高于HBV慢性感染者(Z=-4.360,P＜0.01).在LC重症炎症区域及部分HCC患者中可见HBxAg与FasL在同一区域表达.相关性分析显示,HBV慢性感染和LC患者中,HBxAg与Fas、FasL表达强度均具有相关性(r值分别为0.304和0.368,P值均＜0.05),Fas与FasL的表达也存在相关性(r=0.448,P＜0.01).HBxAg阳性率在高、中病毒载量组(分别为88.9％和69.2％)均明显高于低病毒载量组(为26.7％,P＜0.05). 结论 HBxAg在HBV感染各期均起重要作用,早期主要上调肝细胞Fas表达并诱导肝细胞凋亡,使肝脏炎症坏死加重;后期主要上调肝细胞FasL表达并诱导免疫逃避.HBxAg和高病毒载量在HBV慢性感染者病情发展和癌变中起重要作用.     

38例急性乙型病毒性肝炎肝组织中Fas抗原和Fas配体的表达研究

目的:探讨Fas-FasL系统在急性病毒性肝炎发病中的作用.方法:采用免疫组织化学技术.结果:38例急性乙型肝炎肝组织中的Fas和FasL表达的检出率分别为55.3%和66.5%;Fas和FasL的表达强度与患者的年龄、性别和血清A、A/G和PTA无关,而与血清ALT和TBIL水平有关.较重型(伴桥样坏死)的急性乙型肝炎其Fas和FasL表达比轻型急性乙型肝炎要强.结论:由CTL-Fas-FasL系统介导的肝细胞凋亡在急性乙型肝炎的发病中起了较重要的作用.     

乙型肝炎病毒X基因的蛋白产物对HLA-DR表达的效应

目的 了解HBVX基因蛋白产物对HLA-DR表达的效应。方法 用野生型HBVX基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒pWHXⅡ转染HepG2细胞。用PCR、Southern印迹，ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBVX蛋白，将带重组质粒pWHXⅡ的HepG2细胞的和带有HBV全基因组的2.2.15细胞，在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测。结果 在转染的HepG2细胞和2.2.15细胞表面均清晰地显示有HLA-DR表达，而对照组即不带质粒或只带载体质粒的HepG2细胞则用同法不能在其表面检出HLA-DR的存在。结论 证明HBVX蛋白能在无炎症和外界因素存在下，单独诱导HLA-DR的表达，提示HBVX蛋白有参与乙肝免疫反应机制的可能性。     

HBx-GFP DN突变子长期稳定表达抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒基因的表达

目的　探索和寻找更有效的乙型肝炎治疗新的靶点和新的治疗方法 ,研究其抗病毒基因表达作用。方法　运用基因工程技术 ,建立了HBx GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白 (GFP)的长期稳定表达细胞克隆 ,Northernblot检测细胞内的乙型肝炎病毒相关基因RNA转录 ,应用RIA检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达 ,观察对乙型肝炎病毒基因表达的影响。 结果所构建的X GFP突变子 ,Xwt,GFP质粒均能在 2 .2 .15细胞株中稳定高效表达并使细胞上清液中HBsAgHBeAg表达水平分别较 2 .2 .15组的 ( 10 1± 5.5)ng/ml、 ( 12 1± 8.6)ng/ml显著降低为平均( 7.6± 11.5)ng/ml、 ( 3 5± 3 .5)ng/ml (P <0 .0 1) ,细胞内的病毒 3 .5kb ,2 .1kb及 2 .4kb的RNA与各对照组比较均有显著降低 ,以 2 .1kb及 2 .4kb的mRNA下降最为显著。结论　乙型肝炎X基因DN突变子X GFP能显著抑制乙型肝炎病毒基因转录和S ,C基因的表达。提示 ,X基因亦是乙型肝炎治疗的一个靶基因     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞羧末端结合蛋白反应蛋白表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂(DSB)损伤修复关键因子羧末端结合蛋白反应蛋白(CtIp)的影响.方法 建立稳定表达HBx的HepG2肝癌细胞株(HepG2-HBx)及空质粒对照细胞株(HepG2-vec).用博莱霉素诱导细胞DSB损伤后,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,用实时定量PCR及Western blot检测CtIP的mRNA与蛋白表达水平,并用激光共聚焦显微镜观察CtIp蛋白在细胞内的定位情况.多组数据采用单因素方差分析和SNK-q检验;两组数据间比较用t检验.结果 经检测转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-HBx)能稳定表达HBx.博莱霉素处理后,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞的凋亡比例分别为16.90%±0.89%和15.30%±0.86%,差异无统计学意义(q=2.074,P＞0.05),但死亡细胞比例分别为8.71%±0.74%和4.90%±0.46%,差异有统计学意义(q=7.126,P＜0.01) ;同时两种细胞株都出现了细胞周期G2/M期阻滞,差异有统计学意义(F=11.401,P＜0.05).HBx使CtIP蛋白表达水平和mRNA表达水平均下调,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞CtIp蛋白的相对表达量分别为0.66±0.04、0.73±0.05,差异有统计学意义(t=2.314,P＜0.05); CtIP mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、1.23±0.08,差异有统计学意义(t=2.732,P＜0.05).同时观察到CtIP蛋白主要在细胞胞核内表达.结论 HBx能干扰肿瘤抑制蛋白CtIp的表达,可能影响细胞DSB损伤的修复.     

慢性乙型肝炎患者肝组织Fas表达与血清可溶性Fas水平的关系

目的探讨患者肝组织中Fas的表达与血清可溶性Fas水平的关系。方法用免疫组化方法检测60例慢性乙型肝炎患者肝组织Fas的表达,同时用酶联免疫吸附试验检测血清可溶性Fas。结果重度慢性乙型肝炎患者血清中sFas水平>中度>轻度,各组间差异有显著意义(P<0.01);慢性乙型肝炎患者肝组织Fas表达的程度和血清sFas水平与肝组织病变的活动性一致。结论 1.肝组织炎症程度与肝组织Fas抗原的表达有关;2.Fas介导的肝细胞凋亡在慢性乙型肝炎的发病机制中起重要作用,抑制肝细胞Fas表达有助于减轻肝细胞损伤程度。     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用. 方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBX转染入HepG2细胞中,建立表达HBX的HepG2/HBx细胞模型;以转染空载体pIRES2-eGFP (HepG2/pIRES2细胞)及未转染的HepG2细胞作为对照.转染后24、48、72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;检测细胞内甘油三酯含量;RT-PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和肝X受体(LXR)αmRNA表达水平;Western blot检测HBX,LXRα及脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表达的变化.多组间比较采用成组设计的方差分析,多组间的两两比较采用q检验;各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析.结果 在转染后24、48、72 h,HepG2/HBx细胞和HepG2/pIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强,仅在HepG2/HBx细胞内有HBx表达,并且随时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义(F= 32.21,P＜0.05),提示成功建立HepG2/HBx细胞模型;在转染后24、48、72h,HepG2/HBx细胞内LXRαmRNA相对表达量分别为0.386±0.055、0.505±0.071、0.649±0.058,SREBP-1 mRNA相对表达量分别为0.395±0.055、0.548±0.047、0.795±0.058; LXRα蛋白的相对表达量分别为0.178±0.036、0.263±0.047、0.347±0.058,FAS蛋白相对表达量分别为0.436±0.055、0.608±0.053、0.827±0.046,各相同时间点均较对照组明显增加(P＜0.05或P＜ 0.01),并均随时间的延长而逐渐增多(P＜ 0.05或P＜0.01),且与HBX表达量均呈正相关(rLXPα= 0.994,rSREBP-1= 0.984,r' LXRα=0.989,rFAS=0.991,P＜0.05).HepG2/HBX细胞内TG含量与对照组相比,差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HBx-LXR α -SREBP- 1/FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达,可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一.