丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白对血清饥饿诱导QSG7701细胞凋亡的影响

HCV相关性肝癌的致病机制尚不清楚。人们发现细胞凋亡的抑制有利于逃避机体的免疫监视及细胞毒性治疗引起的细胞死亡，在肿瘤形成过程中起重要作用。凋亡参与HCV相关性疾病的致病机制及其预后。HCV NS3蛋白在病毒生活周期中起重要作用，且可和宿主蛋白相互作用。已有研究表明，HCV NS3蛋白与肝癌的发生密切相关^[1,2].     

中国丙型肝炎病毒细胞毒性T淋巴细胞表位预测及其多表位疫苗设计

寻求抗HCV疫苗和有效抗病毒药物的探索一直是研究的热点[1].我们应用生物信息学方法,选择HCV核心(C)区、NS3、NS4、NS5等各区的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,进行优势组合,结合中国人人类白细胞抗原(HLA)的频率,设计、合成重组HCV多表位疫苗的基困序列,以达到对CTL表位初步筛选,提高实验成功率的目的,同时为构建多个CTL表位疫苗提供理论依据,为今后HCV疫苗的研究开发积累一定的实践经验.     

丙型肝炎病毒核心区多肽对细胞毒T细胞的作用

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染者体内细胞毒T细胞（CTL）功能缺陷的原因。方法 将HCV核心区多肽皮下注射免疫BALB/c小鼠，用乳酸脱氢酶释放实验检测小鼠脾细胞CTL活性，选择上述多肽中对CTL有抑制作用和增强作用的多肽各2条，交叉组合后共同免疫BALB/c小鼠检测其CTL活性。结果 经单因素方差分析显示，HCV核心区多肽CPA9（39-74位氨基酸），CPB7（67-76位氨基酸），CPB8（71-80位氨基酸）对小鼠CTL有抑制作用，CPA10（5-23位氨基酸），CPB6（63-72位氨基酸），CPB2（131-140位氨基酸），对小鼠CTL有增强作用，CPB2 CPB8，CPB6 CPB8组中效靶比10：1，20：1的CTL活性显著高于对照组，CPB2 CPB7，CPB6 CPB7组与对照组无明显差异。双因素方差分析显示HCV核心区抑制性多肽和增强性多肽有交互作用。结论 HCV核心区多肽CPA9，CPB7，CPB8对小鼠CTL有抑制作用。CPA10，CPB6，CPB2对小鼠CTL有增强作用，HCV核心区抑制性和增强性多肽有交互作用。     

HBV/C热点变异对HLA-A2限制性T细胞表位的影响

乙型肝炎病毒(HBV)变异与人体特异性免疫应答的之间的关系,是阐明变异的生物意义的关键之一,但受方法学的限制迄今所知甚微。应用计算机表位预测和人白细胞抗原(HLA)肽复合物技术,分析了我国HBV慢性感染者C基因热点变异I97L和(或)S87G对HLA—A2限制性T细胞表位的影响。     

丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞活性研究

目的阐明丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在慢性丙型肝炎病毒感染中的作用.方法用标准铬释放法(以从患者肝组织或外周血单个核细胞中经选择性克隆扩增后的CD8+细胞为效应细胞,经EB病毒转染的自身B淋巴母细胞为靶细胞,由能表达HCV1型核心区基因的重组痘苗病毒作为转导载体)对62例慢性丙型肝炎患者肝组织及外周血单个核细胞(PBMC)中的HCV特异性CTL活性(HCV CTL)进行检测,8例非HCV感染的肝病患者作为对照.结果62例慢性丙型肝炎患者中,共有28例(46 7%)肝组织中检测出HCV CTL活性,但HCV-CTL在PBMC中未检出.对照组患者肝组织及PBMC中均未检出.5例非HCV1感染的丙型肝炎患者检测出针对HCV1型表位的HCV-CTL.HCV-CTL阳性的丙型肝炎患者血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)水平及肝组织活动指数均明显高于HCV-CTL阴性的患者,而其血清HCVRNA水平则显著低于后者(P＜0.01).结论1 HCV-CTL主要存在于肝组织内;2存在型交叉性HCV-CTL;3.HCV-CTL活性阳性的患者较HCV-CTL活性阴性者具有较高的疾病活动度及较低的病毒血症水平;4.HCV特异性CTL在丙型肝炎的发病机制及疾病控制中起重要作用.     

人类白细胞抗原限制性乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位研究进展

不同个体在乙型肝炎病毒(HBV)感染后的免疫学和临床转归不同,这与宿主的人类白细胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)等免疫遗传学背景和HBV自身特性均相关。HLA-I类基因的型别和HBV抗原的序列特点,共同决定某一宿主的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)能     

丙型肝炎病毒多细胞毒性T淋巴细胞表位DNA疫苗诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应

本研究通过构建含有两个丙型肝炎病毒（HCV）细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（Core133-142和El315-322）的多HCVCTL表位DNA疫苗，用其免疫小鼠，研究其引起的特异性CTL应答，以明确由多个HCVCTL表位基因编码直接连接构成的多CTL表位DNA疫苗，其各个HCVCTL表位是否能独立表达，引起各自相应的特异性CTL应答，且多个CTL的联合作用能否能增强总体的CTL杀伤效应，为构建有效安全的多CTL表位DNA疫苗提供理论基础。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的　利用杆状病毒 昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达 ,用SDS PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况 ;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白 ;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白 )为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性 ;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性。结果　HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达 ;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液 ;从 5× 10 7细胞中总共获得 0 .2mg重组蛋白 ,纯度大于 90 %;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段 ;血清学实验证实该蛋白抗原性很好。结论　昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白 ,具有良好的酶学活性以及抗原性。     

人类免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒重叠感染者的临床及免疫特征

目的 观察人类免疫缺陷病毒(HIV)和HCV重叠感染者与慢性丙型肝炎患者临床特征及HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的数量及功能,探讨两组患者免疫功能的差异及其可能的影响因素.方法 以HIV和HCV重叠感染患者59例、慢性丙型肝炎患者36例为研究对象,取治疗前外周血检测肝脏生物化学指标、血常规、外周血T淋巴细胞亚群(CD4+T、CD8+T淋巴细胞计数)及HIV、HCV病毒载量,以酶联免疫斑点法检测HCV特异性CTL的数量和功能,统计学分析两组问免疫功能的差异及与上述检测指标的相关性. 结果 中国河南省有偿献血、单采血浆人群HIV感染者中HIV和HCV重叠感染率达60.8%.ALT、AST值在重叠感染组与HCV组间差异无统计学意义;球蛋白在重叠感染组为(40.3±5.8)g/L,HCV组为(32.8±6.3)g/L,差异有统计学意义(P＜0.01).重叠感染组外周血CD4+T淋巴细胞数明显低于HCV组(P＜0.01),而CD8+T淋巴细胞数高于HCV组(P＜0.01).重叠感染组HCV RNA定量高于HCV组(P＜0.01).重叠感染组对HCV-NS3区肽段的反应强度(每106个外周血单个核淋巴细胞中斑点形成细胞的个数)较HCV组弱,649.34±685.90对比1233.70±1085.16,差异有统计学意义(P＜0.05).重叠感染组白蛋白与HCV病毒载量呈现负相关(r=0.540);重叠感染组对HCV-NS3区肽段反应强度与HIV病毒载量负相关(r=0.356);重叠感染患者CD4+T淋巴细胞数与血小板正相关(P＜0.05).但未见重叠感染组HCV RNA与CD4+T淋巴细胞数量及HIVRNA水平有相关关系.结论 重叠HIV感染有利于HCV的复制,而HIV载量可影响针对HCV的特异性免疫反应,HIV载量高则不利于HCV的清除.慢性丙型肝炎患者重叠HIV感染时,病情易慢性化,预后更差.     

Identification of hepatitis B virus-specific CTL epitopes presented by HLA-A*2402, the most common HLA class I allele in East Asia

BACKGROUND/AIMS: The aim of this study was to identify and characterize hepatitis B virus (HBV)-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) epitopes presented by human leukocyte antigen (HLA)-A*2402, most common HLA class I allele in East Asia. METHODS: HLA-A*2402-restricted CTL epitopes were identified by reverse immunogenetics. Immunogenecity of these epitopes was investigated using peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from HLA-A24+ patients with acute hepatitis B. RESULTS: An HLA-A*2402 stabilization assay demonstrated that 36 of 63 HBV peptides carrying HLA-A*2402 anchor residues have high- and medium-HLA-A*2402 binding affinity. Two (C117-125 and P756-764) of the 36 peptides induced peptide-specific CTLs. CTL clones and lines specific for these peptides killed HBV recombinant vaccinia virus-infected target cells expressing HLA-A*2402, indicating that these two peptides are CTL epitopes presented by HLA-A*2402. These two peptides were able to induce specific CTLs in 7 and 11 of 12 HLA-A24+ patients with acute hepatitis B, respectively. CONCLUSIONS: We identified two immunodominant CTL epitopes restricted by HLA-A*2402. Because HLA-A*2402 is the most common allele in East Asia, a region in which there are approximately 200 million HBV carriers, these epitopes will be useful for analysis of CTL responses in patients from East Asia.     

乙型肝炎患者HBV X蛋白特异性CTL表位变异分析

目的 比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎HBV X 蛋白特异性CTL表位变异差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理.方法 对393例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因与X基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的6个HLA-A2限制性X蛋白特异性CTL表位序列分析,对患者各个表位变异的差异进行卡方检验.结果 190例(48.35%)患者HLA-A2阳性,其中急性乙型肝炎(AHB)67例,慢性乙型肝炎(CHB)52例,慢性重型乙型肝炎(CSHB)71例.CTL表位变异分析结果如下:对三组所有患者进行比较时,X92-100表位变异发生频数三组患者比较有非常显著性差异(P＜0.01);对三组中HBV C基因型患者进行比较时,X92-100和X115-123表位变异发生频数三组患者比较有显著性差异(P＜0.05);对三组中HBV B基因型患者进行比较时,各表位变异发生频数三组患者比较无显著差异.结论 某些HBV X蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异且受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关.     

树突状细胞的非特异性免疫功能降低对HBV、HCV清除及细胞毒性T淋巴细胞应答无影响

目的 观察HBV、HCV感染者树突状细胞(DC)的非病毒特异性免疫功能状态与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答以及病毒清除的关系。方法 对25例成人慢性HBV和HCV合并感染者进行了间隔8年的两次调查、依据临床转归分为HBV和HCV均清除组(A组)14例、单独HCV清除者(B组)6例，单独HBV消除者(C组)3例，HBV和HCV均未清除者(D组)2例，对照组(N组)为同一地区健康献血员11例。体外分离培养DC，检测其表型及抗原摄取功能、刺激异体淋巴细咆增殖能力和4组感染者的CTL免疫应答情况。结果 B、C、D组与A组、N组比较，DC的非病毒特异性免疫功能降低，表现为CD86表达的降低、刺激异体淋巴细胞增殖的能力下降以及抗原摄取能力降低。A组对HBV和HCV的4条抗原表位多肽均有较高的CTL应签率(11／12)；B组对HCV的两条抗原表位多肽均有应答(5／5)，但无对HBV两条表位多肽均应签者、仅有1例对P2有反应；C组对HBV的抗原表位多肽均有应答，但无对两条HCV表位多肽均应答者；D组及N组对HBV或HCV所有实验多肽均无应答。结论 HBV和HCV的清除与病毒特异性的CTL应答相关。HBV和(或)HCV持续存在可能是导致DC功能异常的原因。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒5＇端非编码区和NS3蛋白酶共调控外分泌性碱性磷酸酶表达细胞模型的建立及意义

目的 构建丙型肝炎病毒5'端非编码区(HCV 5'NCR)和NS3丝氨酸蛋白酶共调控外分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达细胞模型,并分析其用于抗HCV药物筛选和评价的可行性。 方法 用聚合酶链反应技术扩增HCV 5'NCR和NS3/4A片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2-Control的SEAP基因上游,构建含HCV 5'NCR-NS3/4A-SEAP嵌合基因的重组表达质粒pNCR-NS3/4A-SEAP。将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,用化学发光法检测SEAP的表达,并观察HCV 5'NCR区对应的反义寡聚核苷酸(ASODN)和丝氨酸蛋白酶抑制剂TPCK对SEAP表达的影响。 结果 重组质粒pNCR-NS3/4A-SEAP有高强度SEAP表达,5μmol/L、10μmol/L ASODN和100μmol/L TPCK对SEAP表达有显著抑制作用(t值分别为4.315、6.985、6.949,P值均<0.01)。 结论 重组质粒pNCR-NS3/4A-SEAP的SEAP表达受HCV 5'NCR和NS 3蛋白酶共调控,建立的细胞模型可用于以HCV 5'NCR和NS3蛋白酶为靶位点的药物筛选和评价。     

Effects of the Chemokine Receptor 5 (CCR5)-Delta32 Mutation on Hepatitis C Virus-Specific Immune Responses and Liver Tissue Pathology in HCV Infected Patients

Background:

The specific antiviral T cells provide CC chemokine receptor 5 (CCR5) for the immune response during the hepatitis C virus (HCV) infection. Heterogenous and/or homozygous 32 base pair deletion in CCR5 gene (CCR5Δ32 bpdel) leads to reduced protein expression.

Objectives:

In the current case control study, we aimed to compare the histopathological findings of liver to the CCR5Δ32 bpdel mutation profiles, expression and some other clinical findings in patients with chronic HCV infection.

Materials and Methods:

Multiple Strip Assay reverse hybridisation and Real Time PCR techniques were used to determine the germline CCR5 mutations and immunohistochemical technique was used to evaluate the gene expression in targer tissue biopsies.

Results:

Target CCR5 WT/WT, WT/Δ32, and Δ32/Δ32 genotypes were observed in 91.4%, 8.6% and 0.0% for HCV positive patients and 98.3%, 1.7% and 0.0% for control group respectively. The histologic activity index (HAI) was significantly lower (4.0 ± 1.0) in the mutated group than the non-mutated group (5.7 ± 1.0). Decreased fibrosis levels were detected in HCV positive mutated group.

Conclusions:

Results showed that CCR5 polymorphism was more frequent in HCV positive patients than in healthy population in Turkish population. Current results also showed that mutated CCR5 signalling pathway due to CCR5-Delta32 may potentially result in subtle reduction of HCV specifity to the drug responses due to the positive impact on liver inflammation, fibrosis levels and liver destruction in HCV infection.     

慢性丙型肝炎患者2型糖尿病并发率调查及其基因型特征分析

目的通过调查慢性丙型肝炎患者2型糖尿病并发率及其与所感染丙型肝炎病毒（HCV）基因型的关系。进一步探讨糖尿病是否为丙型肝炎的肝外表现之一。方法采用荧光定量聚合酶链反应和聚合酶链反应一微板核酸杂交酶联免疫技术对308例慢性丙型肝炎、305例慢性乙型肝炎患者进行乙型肝炎病毒、HCV定性．定量检测和HCV基因型分析并比较其与对照人群糖尿病并发率的差异。结果慢性丙型肝炎患者糖尿病并发率为32．79％，明显高于慢性乙型肝炎（9．84％）及对照组（8．39％）。合并糖尿病的慢性丙型肝炎患者血清丙氨酸氨基转移酶及总胆红素水平显著高于未合并糖尿病者，且以1b型HCV的感染率为最高，占40．59％，与未合并糖尿病者相比差异有统计学意义。结论慢性丙型肝炎患者糖尿病并发率高，以1b型多见，且病情相对较重。