子宫内传播中乙型肝炎病毒部分S区基因的变异

目的 以丈夫无乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染标志的４例女性携带者与妻子无ＨＢＶ感染标志的６例男性携带者及子宫内感染ＨＢＶ的胎儿为对象，研究子宫内传播中ＨＢＶ Ｓ区的变异。方法 以双脱氧链末端终止法检测母儿，父儿所携ＨＢＶ Ｓ区４５１－６６０位核苷酸序列。结果 母儿，父儿间同源性９８％－１００％，检出４９１，４９４，５３０，５４６，５８１位点变异致使１１３，１１４，１２６，１３１，１４３位氨基酸替代，其     

快速简便筛检乙型肝炎病毒C基因启动子变异的方法及应用

目的明确中国乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区段变异特点及其可能的临床意义。方法应用错配聚合酶链反应限制性片段长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）方法，结合核苷酸序列分析，检测１４３例ＨＢｓＡｇ阳性的ＨＢＶ慢性感染者中Ｘ基因／ＢＣＰ区的核苷酸（ｎｔ）１７６２碱基由Ａ→Ｔ和１７６４碱基由Ｇ→Ａ变异。结果在１１４份ＨＢＶＤＮＡ阳性血清中，３７例感染ＢＣＰ变异株，其中３１例为慢性肝炎病例，６例为慢性ＨＢＶ无症状感染者（ＡｓＩ）；其中４１例ＨＢｅＡｇ阳性ＡｓＩ中仅２例检出，１８例ＨＢｅＡｇ阴性ＡｓＩ中也有４例检出。ＨＢｅＡｇ阳性的６５例中，１３例有ＢＣＰ区变异，而ＨＢｅＡｇ阴性的４９例中，２４例有ＢＣＰ区变异（Ｐ＜０．０１）。结论错配ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测这一对点突变，具有快速、简便、适用的优点；ＨＢＶ毒株ＢＣＰ变异可能与肝病变活动有一定关系。     

引起细胞病变的甲肝病毒BJ—1株结构蛋白VP4—VP2基因序列的测定

测定我室分离的甲型肝炎病毒ＢＪ－１株结构蛋白ＶＰ４－ＶＰ２基因区的核心苷酸序列。方法从ＢＪ－１感染的Ａ５４９细胞中提取病毒ＲＮＡ模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增相应的ｃＤＮＡ片段，测定其核苷酸序列。结果ＢＪ－１株与野型株ＭＢＢ比较，ＶＰ４－ＶＰ２区有４个核苷酸变异，同源性为９９．５％，推论的氨基酸序列有１个氨基酸变异，同源性为９９．６％。与ＨＭ－１７５比较，有３０个核苷酸变异，同源性为９５．９％（７０５     

乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究

以乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)Ｃ基因启动子 (ＣＰ)变异来探讨ＨＢＶ准种在慢性感染者中的存在意义。以中国株ＨＢＶ基因序列为依据 ,设计特异性聚合酶链反应 (ＰＣＲ)引物 ,自 3例慢性ＨＢＶ感染患者外周血血清中扩增ＨＢＶＣＰ序列 ,克隆入 ｐＧＥＭＴｅａｓｙ质粒 ,随机挑选克隆进行ＤＮＡ测序以确定病毒的变异程度。测序结果发现ＨＢＶＣＰ序列高度保守 ,但在ＴＡＴＡ样盒 ( 1 3)可发生多种点突变 ,其中 184ｎｔ(Ｔ→Ｃ)位替换突变最为常见。在直接重复序列 (ＤＲ)Ｉ上游存有一缺失突变高发区。ＣＰ区内有一缺失高变区 ,ＴＡＴＡ样盒 3的变异…     

重型肝炎血清HBV前C区A83变异株比率的动态观察

目的 了解ＨＢＶ前区Ｃ区Ａ８３变异与重型肝炎的关系。方法 用套式错配ＰＣＲ限制片段长度多态性分析和凝胶光密度图象分析仪及定量ＰＣＲ,对９例重型肝炎患者血清ＨＢＶ变异株的比率和ＨＢＶ ＤＮＡ含量进行测定和动态观察。结果 Ａ８３变异株在６例阳性率中均与野生株呈混合感染,其比率〉５０．０％的仅２例,存活死亡各１例,〈３１．０％的４例均死亡,变异株的出现及其比率变化与ＨＢＣＶ ＤＮＡ含量的消长一致,但无统     

乙型肝炎病毒X基因准种与变异特点的研究

以乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)Ｘ基因序列的异质性表现来探讨ＨＢＶ准种在慢性感染者中的存在状态。用中国株ＨＢＶ基因序列为依据 ,设计特异性聚合酶链反应 (ＰＣＲ)引物 ,自 3例慢性ＨＢＶ感染患者血清中扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆入 ｐＧＥＭＴｅａｓｙ质粒 ,随机挑选克隆进行ＤＮＡ测序以确定病毒的变异程度。测序结果提示 ,来源于不同患者ＨＢＶＸ基因序列高度保守 ,序列同源性为 98.9%～ 99.8% ,但每个序列均不一致 ,符合准种判断标准。Ｘ区存在广泛的点替换突变 ;缺失突变占测序克隆总数的 33.3% ,变异区域集中于 12 3位氨基酸编码核苷酸之后…     

乙型肝炎病毒感染经精子传播的可能性研究

目的研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染经精子传播的可能性。方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）患者精子中的ＨＢＶＤＮＡ（地高辛配基标记探针原位杂交及３２Ｐ标记探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交法）；并用正常人精子进行ＨＢＶＤＮＡ俘获试验；对引产胎儿标本进行ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ（ＡＢＣ免疫组化法）及ＨＢＶＤＮＡ的检测。结果在２２例慢性乙肝患者精子标本中，３例检出ＨＢＶＤＮＡ，分布于精子的膜部和核心部。对母亲无ＨＢＶ感染、父亲为慢性ＨＢＶ感染者的４例胎儿的检测表明，在１例胎儿的肝、小肠、肾、肺、骨骼肌中检出了３．２ｋｂ的游离型ＨＢＶＤＮＡ及ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ的表达；该胎儿的父亲精子亦检出ＨＢＶＤＮＡ。体外试验表明正常人活精子能俘获ＨＢＶＤＮＡ，被俘获的ＨＢＶＤＮＡ在精子内的分布位置与乙肝患者精子相同。结论乙肝病毒可能通过感染精子垂直传播，精子被感染的机制涉及对ＨＢＶＤＮＡ的主动性捕获     

HBV X基因／C基因启动子变异在重型肝炎病人的发生率

目的：了解重型乙型肝为病人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因／Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）变异性发生情况，方法；用错配聚合酶链反应（ＰＣＲ）限制性片长度多态性分析（ＲＦＬＰ）检测中国不同地区５８例重型乙型肝炎病人ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区变异，并与前Ｃ区变异情况比较，部分病例经测序证实，结果：５８列中可见ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区和／或前Ｃ区变异者４３例（７４％），ＢＣＰ区第２个ＡＴ丰富区有一对点突变核苷酸（ｎｔ）１７６２碱     

抗—HBe阳性慢性乙型肝炎病毒感染：病毒前C变异与病变活动

抗－ＨＢｅ（＋）的慢性活动性肝炎５１例，以聚合酶链反应检出ＨＢＶ ＤＮＡ４８例（９４．１％）。对６例以反应产物直接序列分析，发现前Ｃｎｔ８３发生Ｇ→Ａ（Ａ８３）点突变，使密码２８由于ＴＧＧ变异为终止密码ＴＡＧ而不能编码ＨＢｅＡｇ。以抗－ＨＢｅ（＋）的慢性无症状ＨＢＶ携带者３０例为对照，仅１２例（４０％）检出弱ＨＢＶ，ＤＮＡ带。５例序列分析未发现Ａ８３变异。结果提示：变异病毒逃避免疫清除而继续活跃复     

抗－HBe阳性慢性乙型肝炎病毒感染：病毒前C变异与病变活动

抗－ＨＢｅ（＋）的慢性活动性肝炎５１例，以聚合酶链反应检出ＨＢＶＤＮＡ４８例（９４．１％）。对６例以反应产物直接序列分析，发现前Ｃｎｔ８３发生Ｇ→Ａ（Ａ８３）点突变，使密码２８由ＴＧＧ变异为终止密码ＴＡＧ而不能编码ＨＢｅＡｇ。以抗－ＨＢｅ（＋）的慢性无症状ＨＢＶ携带者３０例为对照，仅１２例（４０％）检出弱ＨＢＶＤＮＡ带。５例序列分析未发现Ａ８３变异。结果提示：变异病毒逃避免疫清除而继续活跃复制，与病变持续活动有关。     

新生期树鼩接种人乙型肝炎病毒的长期实验观察

目的 观察新生期树鼩接种HBV后体内HBV感染标志物的长期动态.方法 6只树鼩于新生期接种人HBV DNA阳性血清,每4-6周抽血1次和每6～12周做肝活体组织检查1次,应用巢式聚合酶链反应(nPCR)、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、Southern blot、酶联免疫吸附试验和免疫组织化学染色等方法动态观察血清和肝组织中HBV感染标志物的消长,用电镜寻找肝组织内的HBV颗粒和用光镜观察肝组织病理变化.结果 新生期树鼩接种后48周,3只动物(1、2和6号)血清和肝组织标本经多对引物进行的nPCR,均稳定显示HBV DNA阳性,肝组织HBVcccDNA阳性;FQ-PCR显示血清和肝组织HBV DNA的拷贝数分别为103-104/ml和每微克肝组织总DNA 107～108拷贝;Southern blot检测显示肝组织存在HBV复制中间体HBV cccDNA和HBV单链DNA;酶联免疫吸附试验检测显示血清HBsAg持续阳性;免疫组织化学染色可见数量逐步增多的HBsAg阳性肝细胞.其中的1号动物至接种后2年每微克肝组织总DNA仍可测得107～108拷贝的HBV DNA,电镜下可见疑似HBV颗粒.另3只动物除nPCR显示肝组织HBV DNA阳性条带和FQ-PCR显示低拷贝数(每微克肝组织总DNA103拷贝)HBV DNA外,其余的HBV感染标志物均为阴性或一过性阳性.结论 新生树鼩能够长期感染HBV,并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在.     

乙型肝炎病毒S/C基因位点反义锁核酸在小鼠体内抗病毒疗效研究

目的 探讨针对HBV S/C双基因位点反义锁核酸对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法 将30只HBV转基因小鼠随机分为5组,每组6只.分别为5%葡萄糖液对照组、空脂质体对照组、单靶区S组,单靶区C组、双靶区SC组.反义锁核酸片段经尾静脉注入小鼠体内,采用时间分辨免疫荧光技术定量检测血清HBsAg;实时荧光聚合酶链反应定量检测血清HBV DNA含量;逆转录聚合酶链反应检测肝组织HBV C-mRNA的表达;免疫组织化学法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达,自动牛物化学分析仪检测血清白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐;小鼠肝,肾脏做常规病理切片,观察反义锁核酸对小鼠脏器的影响.应用SPSS12.0统计学软件分析.各组问比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验. 结果注射锁核酸后,对HBsAg的表达均显示有较强的抑制作用,单靶区S组,单靶区C组和双靶区SC组的平均抑制率分别为36.6%、31.5%和54.9%;对HBV DNA的复制也有抑制作用,平均抑制率分别为24.0%,21.1%和35.8%.注射后1、3、5 d,HBsAg的平均抑制率分别为14.4%、25.6%和31.3%;HBVDNA的平均抑制率分别为11.0%、19.2%和24.1%;血清中白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等指标,各组结果与对照组比较,差异均无统计学意义;小鼠肝细胞的HBsAg、HBcAg阳性细胞数均较对照组明显减少.小鼠肝,肾脏组织学表现未见异常. 结论 HBV S/C基因位点反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基冈鼠HBV复制和表达有显著抑制作用,且双基因靶位优于单基因靶位.     

Identification of hepatitis B virus vertical transmission from father to fetus by direct sequencing

To identify the possibility of hepatitis B virus (HBV) vertical transmission from father to fetus, eight male HBV carriers whose wives were negative for any HBV marker and their eight aborted fetuses who had been infected with HBV in utero, were studied. S gene 451 approximately 660 nucleotide sequence of HBV in 6 cases of father/fetus pairs and C gene 2022 approximately 2321 nucleotide sequence in the other 2 cases of father/fetus pairs were amplified by nested polymerase chain reaction (NPCR), and sequenced. HBV DNA was detected in the semen and spermatid of male HBV carriers. The homologies of HBV sequences between father and fetus were very high. Six father/fetus pairs had the same subtype adw. The sequences of the fragment were identical between father and fetus in 4 cases. Especially in case 3, both father and fetus had the same point mutation, which caused an amino acid substitution at codon 126. The other two cases had point mutations in the fetus at nucleotide positions 491, 494, 546, 581 resulting in amino acid substitution at codons 113, 114, 131, 143. The C gene 2022 approximately 2321 nucleotide sequences in two cases were identical. There were eleven common point mutations between father and fetus, but those mutations did not cause phenotypic changes. Our finding suggested that HBV vertical transmission from father to fetus was present. A HBV carrier father may transmit the virus to his fetus by spermatid.     

Incidence and characteristics of HBV reactivation in hematological malignant patients in south Egypt

AIM:To investigate characteristics of hepatitis B virus(HBV)implicated in HBV reactivation in patients with hematological malignancies receiving immunosuppressive therapy.METHODS:Serum samples were collected from 53 patients with hematological malignancies negative for hepatitis B surface antigen(HBsAg)before the start of and throughout the chemotherapy course.HBV reactivation was diagnosed when the HBsAg status changed from negative to positive after the initiation of chemotherapy and/or when HBV DNA was detected by realtime detection polymerase chain reaction(RTD-PCR).For detecting the serological markers of HBV infection,HBsAg as well as antibodies to the core antigen(antiHBc)and to the surface antigen were measured in the sera by CEIA.Nucleic acids were extracted from sera,and HBV DNA sequences spanning the S gene were amplified by RTD-PCR.The extracted DNA was further subjected to PCR to amplify the complete genome as well as the specific genomic sequences bearing the enhancerⅡ/core promoter/pre-core/core regions(nt1628-2364).Amplicons were sequenced directly.RESULTS:Thirty-five(66%)of the 53 HBsAg-negative patients were found to be negative serologically for antiHBc,and the remaining 18(34%)patients were positive for anti-HBc.Five of the 53(9.4%)patients with hematologic malignancies experienced HBV reactivation.Genotype D1 was detected in all five patients.Four types of mutant strains were detected in the S gene product of HBV strains and were isolated from 3 patients with HBV reactivation:T/S120,L143,and I126.HBV DNA was detected in the pretreatment HBsAg-negative samples in one of the five patients with HBV reactivation.In this patient,sequences encompassing the HBV full genome obtained from sera before the start of chemotherapy and at the time of de novo HBV hepatitis were detected and it showed 100%homology.Furthermore,in the phylogenetic tree,the sequences were clustered together,thereby indicating that this patient developed reactivation from an occult HBV infection.CONCLUSION:Past infection with     

肝癌组织中丙型和乙型肝炎病毒基因状况研究

采用逆转录巢式ＰＣＲ技术检测了５１例ＨＣＣ患者的肝癌及癌周肝组织中ＨＣＶＲＮＡ正负链，同时以巢式ＰＣＲ技术检测了这些组织中的ＨＢＶＤＮＡ。结果，１１．８％（６／５１）检出组织中ＨＣＶＲＮＡ正链：其中５例在癌周肝组织，２例在癌组织中检测出ＨＣＶＲＮＡ负链，由于负链ＲＮＡ为ＨＣＶ的复制中间体，不释放到细胞外，其检出ＨＣＶ感染与ＨＣＣ关系的研究提供了进一步的病因证据，组织中ＨＢＶＤＮＡ检出率高达９２．２     

Detection of HBsAg, HBcAg, and HBV DNA in ovarian tissues from patients with HBV infection

AIM: To investigate the presence of HBsAg, HBcAg, and HBV DNA in ovarian tissues from patients with HBV infection. METHODS: HBsAg and HBcAg were examined in ovarian biopsy tissues from 26 patients with HBV infection by immunocytochemistry, and HBV DNA was detected in ovarian tissues by PCR. RESULTS: HBsAg and HBcAg were present with the same positive rate of 34.6% (9/26). The total positive rate was 46.2% (12/26). HBsAg and HBcAg were positive in 6 (23.1%) of the 26 patients. Brown positive particles were diffusely distributed in ovarian cells. The positive rate of HBV DNA was 58.3% (7/12). CONCLUSION: HBsAg, HBcAg, and HBV DNA can be detected in ovarian tissues from patients with HBV infection. The presence of HBsAg and HBcAg in ovarian tissues does not correlate with the HBV markers in serum.     

HBsAg阴性/HBV DNA阳性与S基因变异的关系——附8例报告

目的研究无锡地区HBV感染者HBsAg缺失与S基因变异的关系,探讨其形成机理。方法采用ABBOTT测定 HBV M;套式 PCR检测 HBV DNA并作S基因序列分析;荧光定量法测定HBV DNA含量。结果8例HBsAg缺失者S基因出现了变异,导致HBsAg肽63、82、89、90、91、101、115、154位氨基酸替换,且89、90位氨基酸为联合变异;该模式75％(6/8)系慢性肝炎病人,87.5％(7/8)未使用免疫制剂,其HBV DNA含量是低的,而血清抗-HBs中位数值达239.1mU/ml。结论 HBsAg缺失模式多为自然发生的变异,变异主要发生在 a决定簇以外部分,可改变HBsAg的抗原性,使其不能被现行的试剂所检出,此外HBsAg阴性也与血液中HBV DNA含量低有关。     

乙型肝炎病毒携带者的肝脏病理学特点

目的研究慢性HBV携带者和非活动性HBsAg携带者的肝脏组织病理改变。方法对219例HBsAg阳性且血清ALT持续正常6个月以上的HBV携带者进行了肝组织病理学和免疫组织化学检查,同时检测血清HBV DNA和HBV血清标记物,研究HBV携带者肝组织炎症和纤维化的发生率和程度,分析感染者组织学改变与血清病毒水平、HBeAg及年龄的关系。结果HBV携带者中95．0％（208／219）肝脏组织学有改变,其中轻度炎症和（或）纤维化（G0～1／S0～1）者占50．0％（104／208）,有8．7％（18／208）炎症活动度和（或）纤维化程度在3级（期）或以上。炎症活动度和纤维化程度的分布在慢性HBV携带者与非活动性HBsAg携带者两组间比较,差异无统计学意义;在慢性HBV携带组中,以HBeAg阳性和阴性分层分析,炎症活动度在两组间差异无统计学意义,但纤维化性程度在HBeAg阴性组严重于HBeAg阳性组（χ^2=9．551,P〈0．05）;不同年龄组炎症活动度和纤维化程度总体上差异无统计学意义,但40岁以上年龄组S3～4占21．1％,18岁以下年龄组S3～4仅占7．7％。免疫组织化学检查219例HBsAg全部阳性,HBcAg在慢性HBV携带者组均是阳性,在非活动性HBsAg携带者组中10例阳性（33．3％）。结论绝大部分HBV携带者存在不同程度肝脏炎症和纤维化,其中约50％为轻度改变,8．6%炎症和（或）纤维化程度在3级（期）或以上。炎症活动度和纤维化程度与血清病毒水平无显著相关。     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。