PCR检测淋球菌对环丙沙星的耐药性

目的:了解淋球菌对环丙沙星的耐药性及探索QRDR(喹诺酮类耐药决定区)的快速检测。方法:采集33例淋球菌感染标本,通过药敏试验筛选出对环丙沙星耐药菌株33株,PCR扩增gyrA上QRDR区基因片段。结果:33株淋球菌对环丙沙星全部耐药;所有耐药菌株均经PCR扩增出大小为225bp(对应于QRDR)的基因片段。结论:应用PCR技术可以快速准确地检测gyrA基因的QRDR。     

淋病奈瑟菌对环丙沙星耐药性的基因研究

目的 探讨临汾地区淋病奈瑟菌对环丙沙星的耐药性及其与gyrA基因喹诺酮类耐药决定区(QRDR)之间的关系.方法 采集33例淋球菌感染标本,通过药敏试验筛选出对环丙沙星耐药菌株,设计对应于淋球菌gyrA上QRDR区基因片段的引物,经过聚合酶链式反应(PCR)扩增其目的 基因片段,并对扩增产物进行DNA序列测定.结果 33株淋病奈瑟菌临床分离株对环丙沙星全部耐药;所有耐药菌株均经PCR扩增出大小为225 bp(对应于QRDR)的基因片段;测序结果显示耐药菌株都发生了91位点突变(Ser-91→Phe),其中单独91位点突变的有3株,发生91和95双位点突变的有30株,95位点突变类型有三种:Asp-95→Gly, Asp-95→Asn, Asp-95→Ala,以Asp-95→Gly最为常见,有19株,占gyrA 95位点突变株的63.3%.结论 临汾地区淋病奈瑟菌对环丙沙星的耐药情况很严重;gyrA基因突变在淋病奈瑟菌对环丙沙星耐药中起着重要作用. Abstract： Objective To investigate the occurrence of ciprofloxacin(cip)-resistance among Neisseria gonorrhoeae strains in Linfen region in 2006 and determine the frequency and patterns of mutations in gyrA gene in the ciprofloxacin resistance isolates. Methods A total of 33 gonococcal isolates were collected in Linfen region for Neisseria gonorrhoeae. In vitro, susceptibility tests of ciprofloxacin were performed in 33 isolates, gyrA gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR)assay and the PCR products were directly sequenced in order to see if there were mutations in gyrA gene. Results The 33 clinical isolates demonstrated 100% resistance to ciprofloxacin. The gyrA gene containing quinolone resistance-determining region (QRDR)were amplified by PCR in all clinical isolates. The mutations had amino acid substitutions of Ser to Phe at codon 91(33 strains),and Asp to Gly,Asn,Ala at codon 95 of gyrA respectively. The most common gyrA alteration at codon 95, Asp-95 to Gly was found in 19 strains (63.3 %). Conclusions The resistant strains of Neisseria gonorrhoeae to ciprofloxacin in Linfen region are serious. The results from this study suggested that mutations in gyrA gene play an important role in the development of fluoroquinolone resistance of Neisseria gonorrhoeae.     

淋球菌43株对环丙沙星的耐药性及gyrA和parC基因突变的检测

目的:确定延安地区2002年分离的淋球菌对环丙沙星的耐药率和耐药菌株gyrA及parC基因突变情况.方法:从临床分离43株淋球菌,进行药敏试验.PCR扩增gyrA和parC基因,产物直接测序.结果: 43株淋球菌菌株中,耐药株为37株,耐药率为86%.耐药菌株gyrA基因的突变形式是Ser-91→Phe和 Asp-95→Gly.parC基因最多见的突变是Asp-86→Asn和Ser-87→Arg,另外还检测到了Glu-91→Gly 和Arg-116→Leu.gyrA 突变见于所有的敏感性下降株和耐药株,parC突变见于耐药株,但有一株MIC为0.5 μg/mL的菌株也存在parC突变.结论:延安地区淋球菌gyrA和parC基因突变是形成淋球菌耐环丙沙星的主要原因.     

淋球菌对氟喹诺酮类药物敏感性及其耐药机制的研究

目的 了解长沙地区淋球菌流行株对氟喹诺酮类药物的耐药现状,探讨淋球菌对氟喹诺酮类药物耐药的分子机制.方法 纸片扩散法检测126株淋球菌对4种氟喹诺酮类药物的敏感性.E-test法定量检测其中63株淋球菌环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC).对淋球菌喹诺酮类药物作用靶位编码基因gyrA和parC的喹诺酮耐药决定区(QRDR)进行PCR扩增和直接测序分析.结果 淋球菌对氧氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星、依诺沙星耐药率分别为70.6%、81.7%、72.2%和82.5%.环丙沙星MIC为0.004～12.0μg/mL,耐药率65.1%.对环丙沙星敏感的菌株gyrA和parC基因均未发生突变,而中介或耐药菌株均出现gyrA突变或同时伴有parC 突变,且所有parC突变均发生在gyrA突变基础上.突变位点包括gyrA上Set91→Tyr,Set91→Phe,Asp95→Gly,Asp95→Ala,Asp95→Ash以及parC上Gly85→Cys、Asp86→Asn、Set87→,Arg、Ser87→Ile、Ser87→Asn、Ser88→Pro、Glu91→Lvs、Glu91→Gly.其中以gyrA Ser91→Phe频率最高.结论 长沙地区淋球菌流行株对氟喹诺酮类药物耐药已十分严重.淋球菌对氟喹诺酮类药物耐药与gyrA和parC基因突变密切相关;GyrA Ser91→Phe是形成该耐药性的关键突变.多位点突变具有协同作用,可使耐药性进一步增强.     

淋病奈瑟菌gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区突变与环丙沙星耐药相关性研究

目的分析宁波地区淋病奈瑟菌临床菌株gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变类型及与喹诺酮类药物耐药的相关性。方法采用琼脂稀释法检测137株淋病奈瑟菌临床菌株对6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC),PCR法扩增50株环丙沙星耐药的淋病奈瑟菌临床菌株gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区,并进行测序分析。结果 137株淋病奈瑟菌临床菌株对大观霉素、头孢曲松、四环素、青霉素、氧氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为0、0、75.2%、76.6%、97.1%和100%。50株临床菌株测序发现,gyrA基因存在3种核苷酸序列发生错义突变,其中S91F突变发生在所有检测菌株,49株D95位发生突变;parC基因突变位点较多且相对比较分散,其中28株parC基因85、86、87、88和91位发生单位点突变,9株parC基因发生双重突变。结论青霉素、四环素、氧氟沙星和环丙沙星已不能作为治疗淋病的常规用药,大观霉素和头孢曲松仍可推荐用药。gyrA和parC基因突变在淋病奈瑟菌对喹诺酮类药物耐药中起重要作用。     

环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌喹诺酮耐药决定区基因突变分布特征

目的比较研究环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌的喹诺酮耐药决定区（QRDR）的基因突变分布特征。方法对临床分离甲型副伤寒沙门菌QRDR基因进行扩增和测序分析,比较环丙沙星敏感性降低菌株与环丙沙星敏感菌株QRDR基因突变点差异。结果环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌QRDR基因存在较明显的突变特征,其中gyrA的Ser83及parC的Thr57位点突变占主导（分别占78.3%和91.3%）,Ser83位点突变率与敏感株相比存在明显差异。结论喹诺酮耐药决定区的基因突变可能是导致甲型副伤寒沙门菌对环丙沙星敏感性降低的原因之一。     

Study of isolation of fluoroquinolone-resistant Ureaplasma urealyticum and identification of mutant sites

目的：研究Uu临床株对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法：从184个临床Uu株中筛选出13株对6种氟喹诺酮类药物呈不同程度耐药的菌株,PCR扩增其gyrA,gyrB,parC和parE基因的QRDR区。产物测序后和标准敏感株进行序列比较。结果：序列比较结果表明gyrA QRDR第87位核苷酸C到A的突变导致GyrA第95位天冬氨酸被谷氨酸替代,parC QRDR的第50位核苷酸C到T的突变导致ParC第80位丝氨酸被亮氨酸所替代。结论：这些结果表明gyrA QRDR第87位核苷酸C到A的突变与parC QRDR的第50位核苷酸C到T的突变和Uu对氟喹诺酮类药物的耐药相关。     

gyrA和 parC基因突变与解脲支原体喹诺酮类药物耐药相关性研究

目的探讨解脲支原体gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变与喹诺酮类药物耐药的相关性。方法用支原体培养、鉴定和药敏一体化试剂盒分离获得42株解脲支原体并检测对3种喹诺酮类药物的耐药性,同时PCR法扩增临床分离株的gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区并进行测序分析。结果对3种喹诺酮均敏感1株,41株至少对1种药物呈现不同程度耐药。gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区测序发现上述敏感株和1株耐药株不发生突变,其余40株耐药株gyrA和parC基因发生D112E和(或)S83L突变。结论 3种喹诺酮类药物耐药均较严重,已不适合作为临床推荐用药,解脲支原体gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区突变与耐药密切相关。     

临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌gyrA基因突变的研究

目的：检测临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌DNA促旋酶gyrA基因突变情况。方法：收集临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌30株及敏感株10株，测定其对萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)；用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因部分片断，对PCR产物进行限制性片断长度多态性(PCR—RFLP)及单链构象多态性(PCR—SSCP)分析，检测gyrA突变情况。结果：30株耐喹诺酮菌株都检测到gyrA基因突变，PCR—RFLP均显示两条不同于敏感株的电泳带，其PCR—SSCP则检测到4种不同于敏感菌的迁徙率条带；而10株敏感菌均未检测到gyrA基因突变。结论：阴沟肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性与gyrA基因突变有关，gyrA基因第83位氨基酸密码子突变可能为其耐药的主要原因。     

餐饮从业人员耐喹诺酮类药物大肠埃希菌基因突变研究

目的调查和分析餐饮从业人员体检人群分离的大肠埃希菌gyrA、gyrB、parC、parE基因的突变特征。方法用加入4μg/mL环丙沙星营养琼脂平板筛选耐环丙沙星大肠埃希菌耐药菌株,PCR方法扩增其gyrA、gyrB、parC、parE基因,琼脂稀释法测定环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC)值。结果共分离到112株环丙沙星耐药大肠埃希菌,所有菌株的MIC值都介于16～512μg/mL之间。gyrA检测到3种突变类型:112株都出现Ser83→Leu替代,103株发生Asp87→Asn替代,7株菌出现Asp87→Tyr替代。gyrB检测到2种突变类型:6株菌出现Ser343→Phe替代,9株菌出现Ser492→Asn替代。parC共检测到7种突变类型:112株菌都发生Ser80→Ile代替,12株大肠埃希菌发生Glu84→Val代替,5株菌发生了Ala56→Thr替代,各有1株菌发生Glu84→Gly和Glu84→Lys代替,另外各有1株发生Ala108→Thr和Val144→Gly替代。parE基因共检测到2种突变类型:有2株菌发生了Leu445→His代替,49株菌发生Ser458→Ala代替。其中gyrA Ser83→Leu、Asp87→Asn、Asp87→Tyr替代和parC Ser80→Ile、Glu84→Val、Glu84→Gly、Glu84→Lys代替,为gyrA和parC喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变引起的氨基酸替代类型。所有菌株都有2个及以上氨基酸位点的突变,都是高耐药菌株。环丙沙星的MIC值32μg/mL以上的耐药菌株都发生了3个以上位点的突变。Spearman相关系数显示,gyrB492、parE458的突变与环丙沙星的MIC值成正相关,差异有统计学意义(r=0.226 9,P=0.016 1;r=0.273 7,P=0.003 5)。结论餐饮从业人员耐喹诺酮药物的大肠杆菌gyrA、gyrB、parC、parE基因具有多种氨基酸替代类型,gyrB492、parE458的突变与环丙沙星的MIC值呈正相关。     

淋球菌多重耐药系统基因突变位点检测及底物分析

目的检测淋球菌多重耐药株的MtrR基因及FarAB基因的点突变位点,比较二者耐药基因及耐药底物的差异。方法收集淋病患者分泌物标本分离出各型耐药淋球菌株,PCR扩增各菌株中MtrR基因、FarAB基因并测序。结果各型淋球菌耐药株中检测出MtrR,FarAB基因不同突变方式。结论淋球菌多重耐药菌株有Mtr基因、FarAB基因突变造成了淋球菌的不同程度的耐药性能,增加了淋球菌对Has的耐受性,对改变临床抗生素用药具有重要指导意义。     

gyrA和parC介导的淋病奈瑟菌对环丙沙星耐药机制研究

目的探讨淋病奈瑟菌对环丙沙星的耐药机制。方法采用K-B纸片法检测27株淋病奈瑟菌的耐药率,PCR扩增gyrA和parC基因,测序分析DNA序列。结果27株淋病奈瑟菌对青霉素、四环素以及环丙沙星的耐药率均为100%,而大观霉素和头孢曲松100%敏感;DNA序列分析表明:环丙沙星耐药株均存在gyrA和parC基因的突变,其中gyrA基因的突变位点发生在第91位、95位氨基酸,parC基因的突变发生在第86位、87位、88位和91位氨基酸。结论淋病奈瑟菌的耐药与gyrA和parC基因突变有关。     

淋球菌对环丙沙星耐药机制的研究

目的:探讨淋球菌对环丙沙星耐药机制。方法:从临床分离株淋球菌,进行药敏试验,菌内聚积的环内沙星浓102度测定,聚合酶链反应()扩增和基因片段,产物作单链构象多肽性()分析检测其点突变,对PCRgyrAparCPCRSSCPPCR产物直接测序。结果:环丙沙星耐药株占,敏感性下降株占,敏感株占。敏感菌内聚积的环丙沙星浓度为72.5 .6%6.9%,敏感性下降株和耐药株约为和。分析显示敏感性下降株和耐药菌株都存在点突变,经测序6ng/mg3ng/mg0.6ng/mgSSCPgyrA显示以第位氨基酸(GyrA91Ser→)和位(Phe95Asp→)双点突变常见,仅AsnMIC≥0.5μ的菌株才存在基因点突g/mlparC变,经测序显示以第位氨基酸ParC87(Ser→和位(Arg)104Cys→)双点突变常见。Tyr结论:作用靶位(和)的改变gyrAparC和膜耐药机制是淋球菌对环内沙星耐药的主要机制,促旋酶是环丙沙星主要作用靶位,基因突变与较高水平耐药有DNAparC关。     

泛耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究

目的 研究铜绿假单胞菌(PA)泛耐药(PDR)机制.方法 琼脂稀释法测定14种抗菌药物对泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)的最低抑菌浓度(MIC).肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)分析耐药菌株同源性.PCR扩增检测超广谱B内酰胺酶(ESBL)、碳青霉烯酶、质粒介导AmpC酶等分析B.内酰胺类的耐药机制;PCR扩增检测16种氨基糖苷钝化酶基因分析氨基糖苷类耐药机制;PCR扩增检测qnr基因、DNA旋转酶基因gyrA、gyrB和拓扑异构酶Ⅳ基因parC和parE,分析氟喹诺酮类耐药机制;PCR扩增oprD2编码基因及序列分析和MC207110检测外排泵分析膜屏障机制引起的碳青霉烯类耐药机制.结果 19株PDR-PA的ERIC-PCR分型结果显示具有5个型别,其中以A和B型为主,分别有6株和7株.17株检出VEB-3型ESBL基因,其中1株同时检出OXA-10型ESBL基因;未检测出质粒AmpC酶和碳青霉烯酶基因.19株均检出ant(3")I氨基糖苷钝化酶基因,其中18株同时捡出ant(3)Ⅱ酶基因;19株发生gyrA突变,其中14株同时发生了parC突变,未检测出qnr基因.19株oprD2编码基因均发生小片段缺失.16株显示具外排泵机制.结论 提示产生VEB-3型ESBL、aac(3)Ⅱ和ant(3")I氨基糖苷钝化酶、DNA旋转酶gyrA和拓扑异构酶ParC基因发生突变,以及OprD2蛋白缺失和外排泵高表达是本组PDR-PA泛耐药的重要原因.     

多重PCR法检测结核分枝杆菌耐药基因研究

目的:建立多重PCR法快速检测结核分枝杆菌耐药基因。方法:采用多重聚合酶链反应(PCR)同时扩增46株结核分枝杆菌临床分离株、48株北京标准菌株、40例耐药及40例非耐药的结核分枝杆菌临床分离菌株的inhA、katG、rpoB、IS1081等基因并采用测序的方法进行验证。结果:所有耐药样本基因(包括利福平、异烟肼耐药基因)及野生型菌株均被成功扩增。结论:应用多重PCR技术可同时快速检测结核分枝杆菌耐药基因。     

570株铜绿假单胞菌对11种抗菌药物的敏感性及其耐氟喹诺酮机制

目的　了解铜绿假单胞菌的耐药性及其耐氟喹诺酮的机制。方法　Kirby Bauer琼脂扩散法测定 5 70株铜绿假单胞菌对 11种抗菌药物的敏感性 ,琼脂稀释法测定其中 111株对两种氟喹诺酮的最低抑菌浓度 (MIC)。直接序列分析和聚合酶链反应 限制性长度多态性 (PCR RFLP)分析环丙沙星耐药菌株gyrA和parC基因突变。结果　 5 70株铜绿假单胞菌对头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星和头孢他啶的敏感性较高 ,其耐药率分别为 10 9%、11 1%、11 8%、12 5 %。环丙沙星、头孢哌酮 /舒巴坦和哌拉西林的耐药率分别为 2 9 2 %、2 3 5 %和 33 7%。耐环丙沙星和ICU临床分离的菌株对所测试的抗菌药物的耐药率均较高 ,6 0 %以上为多重耐药 (MDR)菌株。 80株耐环丙沙星菌株中 6 6株( 75 % )出现gyrA基因Thr83(ACC)→Ile(ATC)突变 ,5 2株 ( 6 5 % )发生parC基因Ser87(TCG)→Leu(TTG)突变 ,同时存在上述两种突变的有 5 2株 ( 6 5 % ) ,而 31株环丙沙星敏感菌中未发现上述突变。gyrA和parC双基因突变对环丙沙星的MIC显著高于单独gyrA基因突变株和不存在上述突变的菌株 ,P <0 0 5。结论　铜绿假单胞菌的耐药性日趋严重 ,特别是耐环丙沙星和ICU分离株对多种抗菌药物耐药 ;氟喹诺酮类药物作用靶位gyrA和parC的基因突变是临床分离铜绿假单     

鲍曼不动杆菌对常用抗生素耐药性分析

目的 探讨鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药机制。方法 采用K-B法和琼脂稀释法检测35株鲍曼不动杆菌对常用的β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类药物的药敏情况;碘-淀粉法、三维试验、协同法、纸片扩散确证试验检测产β-内酰胺酵睛况;SDS-PAGE法检测其外膜蛋白,直接荧光法检测对环丙沙星的吸收和积累,PCR法扩增tem-1、tzac-4、gyrA基因并对gyrA基因进行测序分析。结果 35株鲍曼不动杆菌中有28株表现为多重耐药（同时耐3种以上药物）,其中产青霉素酶的菌株16株,产头孢菌素酶的菌株10株,产金属β-内酰胺酶的菌株2株,产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的菌株3株;耐药菌株与敏感菌株相比,外膜蛋白在约29kD条带处消失,在26kD条带处明显增强;耐药菌株药物积累量不及敏感菌株,经叠氮钠处理后,积累量上升并接近敏感菌株水平;PCR扩增结果：tem-1除3株敏感菌株和2株耐药菌株为阴性外,其余均为阳性;aac-4均为阴性,gyrA均为阳性,gyrA测序发现耐药菌株有点突变。结论 鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药与产生β-内酰胺酶、外膜蛋白的低通透性和主动外运以及基因的突变有关。     

gyrA和parC介导的淋病奈瑟茵对环丙沙星耐药机制研究

目的探讨淋病奈瑟菌对环丙沙星的耐药机制。方法采用K—B纸片法检测27株淋病奈瑟菌的耐药率，PCR扩增gyrA和parC基因，测序分析DNA序列。结果27株淋病奈瑟菌对青霉素、四环素以及环丙沙星的耐药率均为100％，而大观霉素和头孢曲松100％敏感；DNA序列分析表明：环丙沙星耐药株均存在gyrA和par（3基因的突变，其中gyrA基因的突变位点发生在第91位、95位氨基酸，purC基因的突变发生在第86位、87位、88位和91位氨基酸。结论淋病奈瑟菌的耐药与gyrA和parC基因突变有关。     

广西柳江县农村耐药性大肠杆菌gyrA基因突变的研究

目的了解广西柳江县农村大肠杆菌的耐药性及耐药性大肠杆菌gyrA基因突变特点。方法收集广西柳江县农村腹痛、腹泻患者的粪便,分离培养大肠杆菌,采用K-B法测菌株的耐药性;PCR扩增对氧氟沙星、环氧沙星耐药菌株的gyrA基因,检测gyrA基因序列,分析突变位点。结果经鉴定获得的312株大肠杆菌中,对氧氟沙星、环丙沙星耐药的分别有206株和179株,耐药率分别为66.0%和57.4%,所有耐药株均出现gyrA基因突变,主要是第83和87位点分别出现C-T和G-A的突变。结论柳江县农村患者分离的大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性明显,耐药与gyrA基因突变有密切的关系,基因突变促使丝氨酸和天冬氨酸分别变为亮氨酸和天冬酞胺。     

肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮耐药性关系研究

目的探究肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮类药物耐药性的关系。方法全部试验菌株使用VITEK 2-Compact仪器和GPI卡进行鉴定。通过PCR和单链构象多态性(SSCP)法检测对左氧氟沙星(Levo)与环丙沙星(Cip)耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌GyrA基因有无碱基发生突变,并通过基因测序确定其突变类型。检测了30株粪肠球菌在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/mL利血平后Cip MIC值的改变。结果 PCR-SSCP分析结果表明40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌均扩增出GyrA基因,其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC 29212和敏感菌株的单链泳动带相比较出现异常。其中粪肠球菌在第87位上有密码子改变:GAA变为GGA;屎肠球菌在第83位有密码子改变:AGT变为TAT,这些突变均可引起氨基酸的改变。在M-H琼脂中加入利血平可以提高部分粪肠球菌对环丙沙星的敏感性。结论用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的GyrA基因并通过测序分析,显示有70%(28株)肠球菌碱基发生了突变,说明GyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因,此外还有药物泵出等耐药机制的存在。