大鼠心肌微血管内皮细胞的体外原代培养

目的 体外原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)，并观察其生长特性。方法采用酶蛋白消化法培养大鼠MMVECs，用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化细胞，用第Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原鉴定细胞，倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。结果 成功培养出纯度很高的MMVECs，可用于MMVECs相关实验研究。结论 此原代培养MMVECs的方案具有较好的可操作性和可重复性。     

大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记

背景：脂肪间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的特点,有望成为骨组织工程、细胞治疗等的种子细胞。 目的：培养扩增大鼠脂肪源间充质干细胞,以活体标记并鉴定其分化潜能。 方法：无菌条件下取大鼠双侧腹股沟脂肪,Ⅰ胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第3代脂肪干细胞进行流式检测HCAM、CD106、CD29、CD49D和CD34,生长曲线测定,吉姆萨染色,菲立磁标记,成脂诱导后油红O染色及成骨诱导后茜素红染色钙结节。 结果与结论：细胞呈长梭形漩涡样生长,第3代细胞流式鉴定CD29阳性,CD34、HCAM、CD49d、CD106低表达,生长曲线测定有对数生长期,平台期,菲立磁标记阳性率达80%,并且在一些诱导剂下分化为脂肪细胞及成骨细胞。提示,来源于大鼠腹股沟脂肪分离获得的脂肪源干细胞易于培养和传代扩增,并可活体标记且在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

目的:探索一种简便易行、可培养出高纯度大鼠脑微血管内皮细胞的方法。方法:1月龄SD大鼠,解剖得到大脑皮质,密度离心法获得较纯的脑微血管段后进行原代培养,传代采用差速消化和贴壁方法进行纯化。通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测对培养细胞进行鉴定。结果:密度离心法分离出的大量微血管段呈"串珠样"结构,培养24h可见短梭形、多角形细胞,8～10天基本融合。第2代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达90%。结论:原代细胞采用低分子量葡聚糖加Percoll密度离心法、传代细胞采用差速消化和差速贴壁法纯化可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞。     

兔颈静脉内皮细胞的原位消化、体外获取及培养

目的 建立兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.方法 仅解剖游离单侧兔颈静脉,并保留在原位,对侧颈静脉不进行解剖游离.阻断该静脉段的两端并插管,向该静脉段内灌注Ⅰ型胶原酶进行原位消化.切取该颈静脉段,离体状态下获取兔颈静脉内皮细胞,使用EGM-2培养基培养并传代.倒置显微镜、透射电镜观察获取的兔颈静脉内皮细胞,免疫组化法检测Ⅷ因子.结果 获取的兔颈静脉内皮细胞原代培养7～10d左右可达到80％融合.光镜下细胞为短梭形或多角形,呈“鹅卵石”样排列.透射电镜可见内皮细胞特征性的Weibel-Palade小体.兔Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性.获取的兔颈静脉内皮细胞进行冻存、复苏和传代后均可以正常生长.结论 成功建立了兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。 目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。 方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。 结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

微血管内皮细胞的原代培养

本期“改良肺微血管内皮细胞原代培养技术及细胞鉴定”参考文献12：时全星,孙新,李娟,等．微血管内皮细胞的原代培养[J]．现代生物医学进展,2010,10（19）：3609—3612．本文利用大鼠肺组织的原代培养方法（组织块贴壁法）获得肺微血管内皮细胞（PMVECs）。作者通过改进组织块培养时间、培养液中血清的浓度以及培养瓶的材质等措施,经光镜和电镜扫描观察细胞形态、Ⅷ因子抗原检测进行细胞鉴定,PMVECs细胞生长速度和纯度都比较高,改良后的组织块培养方法简单、快捷、有效。     

改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞的原代培养方法,并对所培养的原代细胞进行鉴定.方法 应用SD大鼠的外周肺组织,进行大鼠肺微血管内皮细胞的原代培养.从动物选取、取材、肺灌注、植块贴壁、培养基及添加物的选择等方面对肺微血管内皮细胞原代培养技术方法进行改进.从细胞形态学特征,免疫组织化学检测血管内皮细胞表面标志物（CD31抗原和Ⅷ因子相关抗原的表达）,荧光显微镜观察异硫氰酸荧光标记植物凝集素与肺微血管内皮细胞特异性结合情况等方面鉴定所培养的肺微血管内皮细胞.流式细胞仪检测细胞纯度,噻唑蓝测量细胞生长曲线.结果 原代培养肺微血管内皮细胞成多角形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样生长,传代培养后可变为梭形呈漩涡样生长或聚集生长.免疫组织化学显示细胞CD31和Ⅷ因子相关抗原的表达阳性;异硫氰酸荧光标记植物凝集素结合试验阳性.细胞生长状态良好、细胞纯度达93.2％.结论 改进后的原代培养方法简便、可靠,获得的肺微血管内皮细胞污染少、纯度高,状态良好,保持了内皮细胞的结构和特性.     

人脐带间充质干细胞的快速分离、纯化及冻存

目的:建立在一般实验条件下快速分离、纯化及冻存人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的简便有效方法并研究其冻存复苏后的增殖及多向分化能力。方法:用胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶次序消化及二步离心法从人的完整脐带中快速分离UC-MSCs,通过把握传代时的消化程度及酸化培养基来快速纯化UC-MSCs,以流式细胞仪检测表面抗原进行鉴定;用简易二步法(-4℃停留30 min,-20℃存放2 h,-80℃长期保存)冻存UC-MSCs,半年后复苏,扩增、传代,检测其胚胎干细胞特异性抗原Oct4、SSEA-4和人端粒酶逆转录酶hTERT的表达情况,并诱导其向神经元样细胞、成肌细胞和肝细胞样细胞分化。结果:通过双酶次序消化结合二步离心法,2 h可提取全脐带中的MSCs,原代培养7 d即可传代,通过适度消化传代和选用弱酸性培养基培养,第3代即可得到纯化的UC-MSCs,UC-MSCs表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,极低表达HLA-DR、CD80、CD86和CD106。简易法冻存半年后复苏的UC-MSCs表达Oct4、SSEA-4和hTERT,可向三个胚层来源的细胞分化。结论:双酶次序消化结合二步离心法是从人的完整脐带中快速分离UC-MSCs的一种简便有效方法,偏酸性环境有利于UC-MSCs的扩增及纯化;简易二步法冻存对UC-MSCs增殖和多向分化能力没有明显影响。     

乳鼠心肌膜微血管内皮细胞的体外培养

目的 改进心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,为进一步研究其结构和功能提供实验数据.方法 选取10～15d龄的SD大鼠,采用植块法培养原代心肌膜微血管内皮细胞,在继代培养中通过差速消化和差速贴壁方法、结合倒置显微镜下形态学的观察进行继代培养和纯化,利用免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原对培养细胞进行了鉴定.结果 成功培养了大鼠心肌膜微血管内皮细胞,细胞呈多边形或鹅卵石状;免疫细胞化学染色第Ⅷ因子相关抗原显阳性.结论 改良了心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,获得了较高纯度的心肌膜微血管内皮细胞,可用于进一步的科学研究.     

成年大鼠和恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养及鉴定

本实验目的是比较成年大鼠和恒河猴骨髓基质干细胞(MSCs)原代培养的细胞形态和生长状况的差异。分别分离成年大鼠和恒河猴的骨髓,密度梯度离心法分离MSCs,传代培养。在细胞生长过程中显微镜观察两种细胞形态及生长状况的差异,并分别进行成脂及成骨诱导。结果表明,在相同的培养条件下,成年大鼠和恒河猴MSCs原代培养细胞形态比较接近,但细胞原代及传代生长状况有差异。大鼠MSCs原代培养及细胞冻存后复苏的生长均快于猴的MSCs。两种动物的细胞都可以向脂肪和成骨细胞分化。猴的MSCs因其生长缓慢和细胞形态的明显改变,需改良其培养条件,才能用于进一步的研究。     

成年大鼠心脏成纤维细胞的分离培养

目的；建立成年大鼠心脏成纤维细胞的离体培养模型。方法：以组织块消化法分离细胞，以差数贴壁法去除其它细胞，常规培养、传代、免疫组化染色进行细胞鉴定并绘制生长曲线观察细胞传代后成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果：第2－4代细胞生长良好、稳定，波形蛋白染色阳性，VⅢ因子相关抗原及肌动蛋白染色阴性。结论：组织块消化法是一种适用于成年大鼠心脏成纤维细胞分离培养的简便方法，第2－4代细胞适于实验。     

三种分离大鼠主动脉内皮细胞方法的比较研究

目的:建立一种有效的、重复性好的大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)分离方法。方法:采用外翻胶原酶消化法、瞬间热处理植环法和植块法分离RAEC,并进行培养、纯化和传代,观察细胞生长和形态,用免疫组织化学法检验Von Villebrand Factor/Ⅷ因子相关抗原进行内皮细胞鉴定。结果:采用植块法分离RAEC,5~7天后可见细胞贴壁生长,14天呈单层铺路石样分布,Ⅷ因子相关抗原阳性细胞(胞浆呈棕黄色)比率为52.3±10.6%,其他两种方法分离后未见上皮细胞贴壁生长。结论:比较外翻胶原酶消化法、瞬间热处理植环法,植块法分离RAEC能培养获得较多内皮细胞,且方法较简便,细胞污染和损伤较少,重复性好。     

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养

目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法。方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力。结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力。结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究。     

改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法

目的:改良大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)培养方法,提高细胞收获量和细胞纯度。方法:选择6～8周龄Wistar雄性大鼠,腹腔内注射200U肝素,摘取左心室剪成若干2mm3小块接种于培养皿中,待其贴壁后,加入含有肝素的DMEM高糖培养液,换液、去除组织块、消化、传代,取第二代MMVECs进行细胞形态学和免疫组化、免疫荧光染色鉴定。结果:贴块法培养48h可见组织块周围有细胞长出,70h长出较多,去组织块后再培养36h,细胞生长至80%～90%融合,呈典型铺路石样。免疫组化和免疫荧光染色证实培养细胞CD31、CD34和Ⅷ因子相关抗原染色均呈阳性,且纯度较高。结论:采用心肌组织贴块及培养液中加入肝素培养的方法可获得高纯度的MMVECs,方法简单,结果可靠。     

原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法。取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO_2培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞。在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的"铺路石样"涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99%以上。该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形。7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性．且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型．也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

人胎儿肝脏间充质干细胞的体外培养及生物学特性研究

目的建立一种在体外分离、培养人胎儿肝脏来源的间充质干细胞(MSC)的方法,并研究其生物学特性。方法采用双酶消化法分离获取人胎儿肝脏MSC并进行体外培养,待细胞达80%以上融合时传代,各传代细胞依次记为P1～P10代细胞,并于倒置相差显微镜下观察细胞形态。取P3、P7、P10代细胞,连续培养7d,观察分析细胞生长曲线。取P5代细胞,采用流式细胞仪检测MSC表面CD34、CD44、CD105、CD13、HLA-ABC、HLA-DR等抗原标志的表达。取P4代细胞,进行体外成骨细胞诱导培养后,采用碱性磷酸酶染色鉴定。冻存传代细胞,分别于2、6个月后复苏细胞,台盼蓝染色计数复苏后细胞存活率。结果原代细胞3d贴壁,6d后开始快速增长并形成集落,11d左右达80%～90%融合,多呈纤维样;传代培养后细胞维持纤维样形态。传代细胞生长曲线具有共同特征:潜伏期约24～48h,对数增殖期约3～4d,对数增殖期后第5～6天进入平台期。流式细胞仪检测显示,MSC表面CD34、HLA-DR呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。碱性磷酸酶染色显示,诱导后细胞的细胞核染成均一的淡蓝色。冻存复苏后细胞存活率达90%以上,且与未冻存传代细胞相比具有相同的生长特性。结论本研究成功地从人胎儿肝脏培养出MSC,为MSC应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源。     

改良法体外培养大鼠脑膜间皮细胞

建立大鼠脑膜间皮细胞(rat meningeal mesothelial cells,RMMC)的体外原代培养模型。用机械吹打法和0.25%胰酶-0.01%EDTA轻消化法收集原代细胞,多次差速黏附处理及传代。传三代,分别进行倒置相差显微镜观察细胞大体结构、扫描电镜(SEM)观察细胞超微结构、苏木素伊红(HE)染色法观察细胞形态、细胞免疫荧光法及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果显示:分离培养的原代细胞在倒置显微镜下为多边形,汇合时呈铺路石样排列;SEM下细胞表面可见大量密集的微绒毛;免疫荧光染色结果显示培养细胞呈细胞角蛋白抗原阳性;免疫细胞化学结果显示培养细胞呈细胞角蛋白和波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原阴性,培养细胞的纯度达96%以上。结论:本实验成功建立了RMMC培养模型,可为脑膜纤维化的形成机制研究提供理想的细胞模型。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。