人脂肪来源干细胞与左旋聚乳酸/聚己内酯支架的体内外生物相容性研究

目的观察人脂肪来源干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)在左旋聚乳酸/聚己内酯(Poly-Llactide/Polycaprolactone,PLLA/PCL)复合支架材料中的生长情况及其生物相容性。方法体外分离、培养和扩增hADSCs,制备PLLA/PCL复合支架。取PLLA/PCL浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到PLLA/PCL支架材料上。体外培养1周,裸鼠皮下分别培养1周、2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况。免疫荧光检测裸鼠体内复合支架材料内细胞平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin,SMA)表达情况。结果hADSCs在PLLA/PCL浸提液中可保持较高的增殖率,表明PLLA/PCL浸提液无细胞毒性。hADSCs接种于PLLA/PCL支架上,经体外、体内培养后,均能长入PLLA/PCL支架的孔隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架内部。经体内培养后,复合细胞的支架比单纯支架有更多的细胞渗入支架内部。细胞材料复合物体内培养2周后,免疫荧光检测发现,支架材料内部分细胞SMA表达阳性。结论 PLLA/PCL复合支架材料,安全无毒,与hADSCs生物相容性好,可作为种子细胞的载体用于组织工程膀胱缺损修复的研究。     

人脂肪来源干细胞与聚己内酯/壳聚糖支架的生物相容性研究

目的观察人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells,hADSCs）在聚己内酯/壳聚糖[Poly（ε-capro-lactone）/chitosan,PCL/CS]支架中的生长情况。方法取PCL/CS浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到PCL/CS支架上,体外培养1周、2周,裸鼠体内培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况,免疫组化HLA-Ⅰ监测经裸鼠体内培养后复合支架上细胞的种属来源。结果 hADSCs在PCL/CS浸提液中可保持较高的增殖率,PCL/CS浸提液无细胞毒性。hADSCs终止于PCL/CS支架后,经过体外、内培养,hADSCs均能长入支架的空隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架。体外培养1周,已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘,体外培养2周后,部分细胞渗透到材料内部。体内培养2周后,大量细胞能渗透到材料内部,同时HLA-Ⅰ抗体检测发现,支架材料内部分细胞HLA-Ⅰ阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于hADSCs。结论 PCL/CS支架安全无毒,hADSCs能在PCL/CS支架上较好生长,该支架可用于组织工程膀胱的研究。     

聚己内酯/壳聚糖与聚己内酯/聚乳酸支架与人脂肪来源干细胞的生物相容性研究

目的对比人脂肪来源干细胞(Human adipose derived stem ceils,hADSCs)与聚己内酯/聚乳酸(Polycaprolactone/Polylactide,PCL/PLA)和聚己内酯/壳聚糖(Polycaprolactone/chitosan,PCL/CS)复合支架的生物相容性,为进一步体内组织修复提供依据。方法体外分离、培养和扩增hADSCs,分别制备PCL/PLA、PCL/CS复合支架,扫描电镜观察支架材料的表面情况。取材料浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性。hADSCs传代扩增后,接种到支架材料上,裸鼠皮下培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况。结果 hADSCs与成纤维细胞相似,呈"梭形",并以集落形式生长。扫描电镜观察PCL/CS孔径在100μm左右,孔隙率为88.76%,而PCL/PLA支架孔径则在40μm左右,孔隙率为91.45%。hADSCs在PCL/CS浸提液中培养1、3、7天的相对增殖率分别为98.6%、101.6%、110.3%,而PCL/PLA组为98.1%、100.7%、108.4%,说明hADSCs在两种浸提液中均保持较高的增殖率,即两种合成支架均无细胞毒性。hADSCs复合两种支架体内培养后,HE染色后可见有大量细胞长入PCL/CS支架内部,同时免疫组化HLA-Ⅰ检测发现,支架材料内部分细胞阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于人,即hADSCs。而在PCL/PLA内部渗透进入的细胞不如PCL/CS支架组。结论 PCL/CS和PCL/PLA支架安全无毒,hADSCs在PCL/CS支架上显示更好的细胞相容性,该支架可以作为hADSCs的载体材料,用于组织工程膀胱修复的研究。     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

皮下预制膀胱脱细胞基质-丝素蛋白双层支架修复大鼠膀胱的实验研究

目的观察膀胱脱细胞基质-丝素蛋白(Bladder acellular matrix graft-silk fibroin,BAMG-SF)双层支架经皮下预制处理后,修复大鼠膀胱扩大术后膀胱缺损的效果。方法取BAMG-SF置于大鼠皮下,分别经1 d、3 d、7 d和14 d后,行组织学染色,评价其体内情况;实验分4组:单纯BAMG-SF组,BAMG-SF皮下预制3 d组、预制7 d组、预制自体组织组(BAMG-SF皮下预制7 d后去除BAMG-SF,保留周围结缔组织),分别修复大鼠膀胱扩大术模型,术后4周行HE、Masson及相关免疫组化染色,评价其修复情况。结果皮下预制7 d,即有大量细胞长入;皮下预制14 d,材料可被自身组织包裹;皮下预制3 d组的血管及肌肉修复程度均优于其他组,自体组织组未见结石形成。结论 BAMG-SF双层支架材料可用于膀胱缺损修复,皮下预制3 d组织修复效果最好,而自体组织组可以避免结石形成。     

聚乳酸-聚羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性研究

目的观察聚乳酸-聚羟基乙酸(poly-lactide-co-glycolide,PLGA)/Ⅰ型胶原复合支架的生物相容性,探讨其作为组织工程阴道支架的可行性。方法取经多聚赖氨酸包被的PLGA置于含0.25%Ⅰ型胶原的醋酸水溶液,制备PLGA/Ⅰ型胶原复合支架。取10~12周龄雌性SD大鼠阴道组织,采用酶消化法分离培养阴道上皮细胞,取第2代细胞进行实验。取复合支架浸提液培养阴道上皮细胞,观察材料细胞毒性。将阴道上皮细胞与复合支架共培养48 h(实验组),检测细胞黏附率;以单纯PLGA支架接种细胞作为对照组。将细胞-支架复合物埋植至SD大鼠皮下,于2、4、8周取材行HE染色、免疫组织化学染色,观察细胞在支架上生长情况。将细胞-支架复合物移植至6只切除阴道组织的SD大鼠阴道部位,于术后3、6个月观察阴道生长情况,6个月后取阴道组织进行组织学观察。结果大鼠阴道上皮细胞在PLGA/Ⅰ型胶原复合支架材料浸提液中生长、增殖良好,细胞毒性为1级。实验组细胞黏附率为71.8%±9.2%,显著高于对照组的63.4%±5.7%(t=2.195,P=0.005)。阴道上皮细胞能在PLGA/Ⅰ胶原复合支架材料上黏附、生长;大鼠皮下埋植2周后,细胞在支架孔隙内生长增殖,成纤维细胞生长;4周支架材料表面形成1~3层上皮;8周后支架材料部分降解,上皮层次增加,呈极性排列,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。细胞-支架复合物原位移植3个月后,大鼠阴道黏膜呈粉红色,有光泽,支架材料大部分降解;6个月时阴道深约1.2 cm,无明显狭窄,阴道黏膜外观类似正常阴道黏膜,皱襞较少,组织学观察示上皮层与正常阴道无明显区别,基底层可见钉状突起,数量少于正常阴道,角蛋白免疫组织化学染色呈阳性。结论 PLGA/Ⅰ型胶原复合支架具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程阴道的支架材料。     

以PHBV为支架构建组织工程化软骨

[目的]探讨聚（羟基丁酸酯．羟基戊酸酯）（PHBV）多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性以及体内外培养方式对软骨形成的影响。[方法]采用“压片-热处理-粒子析出”技术制备PHBV多孔支架。体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养2周，期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况，然后与单纯PHBV支架同植入裸鼠皮下继续培养4、8周后取材，与体外培养至6、10周的细胞一支架复合物同行组织学观察。[结果]电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质；组织学观察示PHBV浅层有新生软骨组织形成，且皮下培养的软骨组织比体外培养的更为成熟。单纯PHBV支架皮下培养没有软骨组织形成。[结论]PHBV可以作为软骨组织工程支架材料。体内培养较体外更有利于组织工程化软骨的形成。     

海藻酸钙敷料的细胞毒性体外检测结果分析

目的:探讨海藻酸钙敷料对体外培养的成纤维细胞相对增殖率的影响,初步评价该材料的细胞毒性作用并探讨对细胞增殖影响最低的条件。方法:第一步:采用四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度(0、50%和100%)敷料浸提液的吸光度,分别计算各浓度下成纤维细胞的相对增殖率,初步评价其细胞毒性。第二步:根据上述结果,继续采用MTT法检测细分浓度(0、10%、20%、30%、40%和50%)敷料浸提液对成纤维细胞增长率影响,测出对细胞增殖无影响的材料溶液浓度。结果:各浓度浸提液均出现较高相对细胞增殖率,其细胞毒性均为0或1级,无毒性。精检MTT结果提示,相对浸提液浓度低于10%海藻酸盐敷料浸提液对成纤维细胞的生长无任何影响,浓度高于20%的浸提液对成纤维细胞的生长开始产生影响,但仍未到毒性标准。结论:海藻酸钙敷料无细胞毒性,具有良好细胞相容性,满足人体植入材料体外细胞毒性实验要求,可作为安全的伤口敷料使用。     

明胶/姜黄素纳米纤维电纺膜皮下环境构建组织工程软骨的可行性研究

目的探讨以明胶/姜黄素电纺材料为支架,在动物皮下构建组织工程化软骨的可行性。方法取兔耳软骨获取软骨细胞作为种子细胞,体外培养扩增,并以明胶电纺膜(对照组)和明胶/姜黄素电纺膜(实验组)为支架构建软骨。将支架材料植入BALB/c裸鼠背部皮下后行大体观察;对支架材料及细胞-支架复合物行电镜观察;对细胞-支架复合物进行细胞增殖率检测;另将体外培养1周的细胞-支架复合物植入BALB/c裸鼠背部皮下,3周、12周后行组织学检测,比较不同时间点的软骨形成情况。结果大体观察显示,相比对照组,实验组材料周围组织血管化受到明显抑制;SEM结果显示,两组材料中细胞均黏附良好;细胞增殖率检测结果显示,姜黄素对细胞增殖无显著影响;组织学观察显示,3周、12周时,两组细胞-支架复合物均有软骨陷窝形成;但相比对照组,实验组材料可见明显吸收,软骨基质形成较厚,均质性更佳。结论明胶/姜黄素材料可作为支架在裸鼠皮下构建组织工程化软骨,具有潜在的应用前景。     

壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的：研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架。方法：应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物。采用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性;采用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态。结果：网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性。尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞,长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架贴附紧密,适度伸展并有基质分泌。结论：网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长．可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道。     

聚羟基乙酸作为支架材料体外构建复层膀胱壁结构的探讨

目的：探讨聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法：采用PGA作为支架材料。并以聚乳酸（polylact acid,PLA）塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞,并体外扩增。以MTT法分别检测P3代膀胱平滑肌细胞（SMC）和尿路上皮细胞（UC）的体外增殖能力。将P3代膀胱平滑肌细胞先接种在支架上,再接种尿路上皮细胞。将细胞一材料复合物体外培养1～2周并行组织学鉴定。结果：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞经过体外培养仍具有较强的体外增殖能力。细胞材料复合物体外培养1周后形成分层排列结构,包括黏膜上皮层和膀胱平滑肌层。免疫组织化学显示平滑肌层α-Smooth Muscle Actin表达阳性,黏膜上皮层广谱角蛋白表达阳性。而细胞材料复合物继续体外培养至2周,细胞从支架上大量脱落。结论：PGA适合作为复层膀胱壁结构体外构建的支架材料。采用PGA作为支架材料并复合膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,可以体外构建出类似复层膀胱壁结构。细胞材料复合物体外培养1周左右较适合进行体内回植修复。     

纳米结构PCL—b—PLLA材料特性及其与犬软骨细胞的生物相容性研究

目的探讨具有纳米结构的聚己内酯／左旋聚乳酸共聚物（PCL—b—PLIJA）作为半月板组织工程支架的可行性，及其与犬软骨细胞的体外生物相容性。方法开环聚合制备PCL-b-PLLA，液-液相分离技术制备纳米结构PCL—b—PLLA支架，固-液相分离技术制备PCL—b—PLLA支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；测定纳米结构支架体外降解率及力学强度。分离培养犬软骨细胞，取第3代软骨细胞接种于纳米结构PCL—b—PLIA（实验组）、PCL—b—PLLA（对照组）支架材料上进行三维培养6d，SEM观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况；细胞支架复合培养3、6、12d后，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。结果实验组支架材料相对分子量150kD，压缩强度为72．6KPa，孔隙率为93％。SEM示实验组支架表面为多孔状，孔壁为纤维网状连接。其降解率起初始较慢，8周后降解速率明显加快。软骨细胞在实验组支架上粘附、增殖优于对照组。随时间延长细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，实验组DNA和蛋白质含量均明显高于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论具有纳米结构的PCL-b—PILA支架具有良好的生物力学性能及可降解性，可显著促进细胞粘附、增殖及合成代谢，有望成为一种较为理想的半月板组织工程支架材料。     

膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性研究

目的:研究膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质(BAM)的生物相容性。方法:分离培养兔膀胱平滑肌细胞,采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行鉴定。将以1×10 5个/mL的单细胞悬液均匀接种于制备BAM支架上,通过与单独培养的膀胱平滑肌细胞作对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比观察两条生长曲线的差异性。 ...     

胶原海绵为载体构建大鼠羊膜上皮细胞复合体的实验研究

目的：大鼠羊膜上皮细胞（AECs）体外培养并种植于胶原海绵形成细胞支架复合体后,探讨细胞在支架上分别于体内及体外时的生长情况。方法：取第三代AECs细胞种植于胶原海绵支架。光镜下及用荧光标记法观察细胞种植前后的增殖情况;ELISA法检测细胞支架上清液中VEGF、bFGF、TGFβ的含量。并通过荧光标记示踪法观察细胞支架植于体内后细胞的存活情况。结果：AECs在胶原海绵支架上生长情况良好,细胞支架上清液中VEGF、bFGF、TGFβ的含量随时间增长呈不断上升趋势,将细胞支架移植于体内后经过观察发现细胞仍存活良好。结论：AECs在胶原海绵支架上及体内移植后生长情况良好,这为利用AECs胶原海绵支架复合体进行细胞治疗奠定了实验基础。     

人脂肪来源干细胞与胶原支架共培养的实验研究

目的观察评价人脂肪来源干细胞(Human adipose derived stem cells,hADSCs)在胶原支架中的生长情况,为进一步体内组织修复研究提供依据。方法取人抽脂术后脂肪,经胶原酶解、过滤、离心获得hADSCs,代传代扩增后,接种到胶原支架上。细胞-材料复合物分别体外培养1周、2周,裸鼠体内培养2周、4周后,HE染色观察细胞在支架上的生长情况,免疫组化HLA-Ⅰ检测经裸鼠体内培养后的复合物上的细胞的种属来源。结果原代培养的hADSCs呈"梭形"或"成纤维细胞"样,并以克隆团形式生长。免疫荧光Vimentin染色阳性。第3代hADSCs经流式细胞鉴定,CD29、CD44、CD105表达阳性,CD45、CD34表达阴性。胶原支架复合hADSCs经过体外、体内培养,hADSCs均能长入胶原支架的空隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架。体外培养1周,已有细胞粘附生长在胶原支架的边缘,体外培养2周后,更多的细胞渗透到材料内部。体内培养2周后,大量细胞占据材料的边缘,有部分细胞能渗透到材料内部甚至材料全层。体内培养4周后,大量细胞渗透支架全层。HLA-Ⅰ抗体检测发现,支架材料内部细胞阳性表达,说明胶原支架内部的细胞来源于hADSCs。结论胶原支架与hADSCs具有较好的相容性,可作为hADSCs的载体材料,用于组织工程缺损修复的研究。     

Optimization of bone tissue engineering in goats: a peroperative seeding method using cryopreserved cells and localized bone formation in calcium phosphate scaffolds

BACKGROUND: Bone tissue engineering by combining cultured bone marrow stromal cells with a porous scaffold is a promising alternative for the autologous bone graft. Drawbacks of the technique include the delay necessary for cell culture and the complicated logistics. We investigated methods to bypass these drawbacks. Furthermore, we investigated the localization of bone formation inside the scaffold. METHODS: Bone marrow stromal cells from seven goats were culture expanded and cryopreserved. One week before surgery, some of the cells were thawed, cultured, and seeded on porous calcium phosphate scaffolds. The constructs were cultured for another week until implantation. The remaining cryopreserved cells were thawed just before implantation and peroperatively resuspended in plasma before combining with the scaffold. Scaffolds impregnated with fresh bone marrow, devitalized cultured constructs, and empty scaffolds served as controls. All samples were implanted in the back muscles of the goats for 9 weeks. RESULTS: Histologic examination showed minimal (<1%) bone in the empty and devitalized scaffolds, 4.2 +/- 5.1 bone area percent in the bone marrow samples, and significantly more bone in both the cultured and peroperatively seeded constructs (11.7 +/- 2.5 and 14.0 +/- 2.0%). The peripheral 350 microm of the implants contained significantly less bone. CONCLUSION: Peroperative preparation of osteogenic constructs with cryopreserved cells is feasible. These constructs yield substantially more bone than the scaffolds alone or scaffolds impregnated with fresh bone marrow. Bone deposition is much less on the scaffold periphery.