黄芪多糖/壳聚糖/聚乳酸为支架的组织工程骨修复牙周组织缺损的实验研究

目的 探讨以黄芪多糖／壳聚糖／聚乳酸（astragalus polysaccharides／chitosan／polylacticacid，AP／C／PLA）为支架的组织工程技术修复水平型牙周组织缺损的可行性。方法成年健康雄性杂种犬10只，体重13±2kg，以犬骨髓基质细胞（marrow stromalcells，MSCs）为种子细胞，分别与AP／C／PLA及C／PLA支架构建组织工程复合物。10只实验犬于双侧下颌第3、4前磨牙颊侧制备水平型牙周缺损模型。将牙周缺损模型随机分为4组（n=10）：A组，缺损直接龈瓣冠向复位缝合，作为空白对照；B组，缺损处植人AP／C／PLA和条件培养基，龈瓣冠向复位缝合，作为培养基对照；C组，缺损处复合植入C／PLA和MSCs，龈瓣冠向复位缝合，作为材料对照；D组，缺损处复合植入AP／C／PLA和Mscs，龈瓣冠向复位缝合，作为实验组。术后8周，分别收集牙周标本行大体观察、X线片及组织学观测。结果 体外诱导培养的MSCs表达1型胶原及碱性磷酸酶，具有成骨细胞活性。各组动物对手术耐受性好，术后观察期内未见支架材料暴露，伤口愈合良好。X线片检查可见，A组牙槽骨密度及高度无明显增加；B组骨密度有一定程度增加，根分叉处增高的牙槽骨量少，邻间牙槽骨无明显增加；C组骨密度增加，根分又处牙槽骨基本恢复原有高度，邻间牙槽骨增加不明显；D组骨密度明显增加，根分叉处和邻间牙槽骨基本恢复原有高度。组织学观察显示，与A组相比，D组形成更多的新生牙槽骨、牙周膜和牙骨质，且新生牙槽骨矿化程度高，骨板排列趋向规则，出现整齐同心圆状的哈佛系统，基本具备骨组织的正常结构；牙槽骨与牙周膜的连接面呈锯齿状，沿根面还可见薄层的牙骨质沉积；新生牙周膜纤维呈束状，排列较密集且呈方向性，类似Sharpey’s纤维。A、B、C、D组新生牙槽骨高度分别为0．83±0．30、1．46±0．55、2．67±0．26及2．90±0.41mm；新生牙骨质高度分别为0．78±0．45、1．30±0．60、2．29±0．18及2．57±0．22mm；新生结缔组织附着高度分别为0．80±0．22、1．33±0．34、2．23±0．42及2．64±0．27mm；各指标D组与A、B、C组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 以AP／C／PLA为支架材料构建的组织工程骨修复水平型牙周骨缺损可以获得部分牙周组织再生。     

组织工程化骨修复下颌骨缺损(附3例报告)

目的探讨以人自体骨髓基质干细胞(hBMSC)作为种子细胞的组织工程化骨在治疗肿瘤术后下颌骨缺损的可行性。方法回顾性分析2005年1月至2005年12月收治3例组织工程骨修复颌面部肿瘤术后下颌骨缺损的临床资料。抽取人骼前上棘骨髓,分离出hBMSC,经体外诱导和扩增,将hBMSC与部分脱钙骨(30%～40%)复合,于体外培养1个月后,手术植入骨缺损区。分别于术后2周、3个月、2年进行PET-CT检查随访。结果 PET-CT示,术后3个月能形成组织工程化骨,并修复了骨组织缺损,临床治疗效果稳定。结论以自体hBMSC为种子细胞,利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织,并能修复下颌骨缺损。     

骨髓基质细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的为验证三维打印研究中动物模型的可靠性，采用骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）修复裸鼠颅骨缺损。方法共10只裸鼠，其中实验组（n=5只）：颅骨缺损区植入BMSCs／脱钙骨；材料对照组：颅骨缺损区植入单纯脱钙骨，采用实验组自身对照（n=5只）；空白对照组（n=5只）：双侧颅骨区造成缺损后旷置。术后3个月取材进行大体观察、组织学和免疫组化（骨钙蛋白）检查。结果术后3个月，实验侧组织质地较硬，组织学表现为骨结构，骨钙蛋白免疫组化阳性；对照侧质地较软，组织学表现为结缔组织，骨钙蛋白免疫组化阴性；空白对照组仍表现为颅骨缺损。结论采用BMSCs可修复裸鼠颅骨缺损，验证了三维打印研究中动物模型的可靠性。     

胶原化的煅烧骨与MSCs复合修复颅骨缺损的实验研究

目的 观察骨髓基质干细胞(MSCs)/煅烧骨/Ⅰ型胶原复合物修复颅骨缺损的能力.方法 18只成年Wistar大鼠颅骨分别制作直径8 mm圆形全层骨缺损.其中6只在全身麻醉及无菌条件下取其左侧股骨,诱导培养的骨髓基质干细胞与煅烧骨/Ⅰ型胶原复合制成复合物修复颅骨缺损,为实验组;6只以煅烧骨/Ⅰ型胶原修复为对照组;6只不修复为空白组.于植入复合物后4周和8周两个时间点处死大鼠,以组织学方法 观察骨修复情况.结果 4周时实验组的植入物与颅骨缺损创缘呈骨性连接,8周时实验组植人物与创缘呈骨性连接,小梁骨增多,小梁间有较多的骨髓组织形成.对照组植入物与创缘以纤维连接为主,极少部分边缘可见骨性连接.空白组颅骨缺损面积未见明显缩小.结论 MSCs和胶原化的煅烧骨有非常好的生物相容性,复合后植入体内能够成骨,可用于颅骨缺损的修复.     

组织工程化骨修复胸壁缺损的实验研究

目的　探索利用组织工程化骨修复胸壁缺损的可行性。方法　实验借助组织工程的基本原理和方法 ,利用猪骨脱细胞基质作为可降解支架材料 ,同时体外扩增自体骨髓间质干细胞作为种子细胞 ,体外构建组织工程化骨组织修复实验用北格犬双侧胸壁各 5cm× 5cm缺损 ,同时在构建的组织工程化骨组织中设计“辅助灌流系统” ,定时注入DMEM培养液、BMP等细胞因子和自体骨髓间质干细胞 ,即保证组织工程化骨中细胞早期营养 ,又维持了局部成骨微环境 ,并同时保证了种子细胞来源。结果　 5只实验动物胸廓未见反常呼吸 ,病理切片证明局部骨组织形成 ;单纯材料对照组可降解支架材料基本吸收 ,伴纤维组织形成。结论　组织工程化骨具有良好的生物相容性 ,并具有一定的强度 ,可防止反常呼吸 ,是一种理想的胸壁缺损修复材料     

组织工程化骨修复四肢骨缺损的初步临床研究

目的探索以人自体骨髓基质干细胞(Human bone marrow stromal cells,hBMSCs)为种子细胞构建的组织工程骨用于修复四肢骨缺损的可行性。方法选择9例四肢骨缺损病例(良性骨肿瘤5例、骨缺损4例)。经病人髂前上嵴,穿刺抽取10mL骨髓,用密度梯度离心法分离得到hBMSCs,用成骨诱导培养液定向培养、扩增,应用第3代的hBMSCs与珊瑚复合,继续在体外培养1周后,手术植入骨缺损区。分别在术后2个月、6个月、12个月和24个月进行临床观察和X线检查。1例病人在二次手术时,在原骨缺损区取出少量新生组织活检,进行组织学观察(HE染色)。结果患者术后X线检查显示,组织工程骨在原位形成新骨,能较好地修复骨缺损。活检标本HE染色显示,局部形成正常松质骨组织。结论以自体hBMSCs为种子细胞,利用组织工程技术制成的自体组织工程骨可以修复四肢骨缺损,并且能够修复较大的骨缺损,但组织工程骨的临床成骨效果与植骨床血供密切相关,目前所使用的组织工程骨植骨方法具有一定的适应证。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

骨髓基质干细胞/胶原凝胶复合物原位构建工程化肝组织

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)与胶原凝胶材料复合后原位植入肝内的组织再生潜能.方法 将来源于雄性SD大鼠的BMSCs与液态鼠尾胶原复合后,原位植入雌性大鼠肝组织挖除部位,分别于植入后1、2周取材.采用苏木素-伊红(HE)染色对植入部位组织学特征进行观察,并采用免疫组化染色和FISH方法分别对白蛋白、CK19及SRY基因进行检测.结果 BMSCs与胶原凝胶复合后,细胞均匀的分布在整个BMSCs/胶原复合物中.体内植入后1周,观察到植入细胞分化出圆形、多角形等细胞形态.植入后两周,组织学显示植入部位形成肝细胞样的细胞集落,免疫组化染色显示这些细胞抗白蛋白抗体染色(Alb)阳性.此外,植入部位还形成由上皮样细胞围成的管状结构,抗CK19抗体染色提示这些上皮样细胞为胆管上皮细胞.原位杂交证实植入部位细胞主要来自植入的雄性大鼠的骨髓基质干细胞.结论 BMSCs与胶原复合后原位植入肝内可形成类肝样组织.该方法经进一步研究有望用于肝脏病损的修复治疗.     

组织工程化软骨修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的 评估同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层软骨缺损的有效性。方法分离收集成年新西兰大白兔软骨细胞进行体外培养。建立双侧兔膝关节软骨缺损模型，用去端肽胶原（atelocollagen）凝胶与所培养的异体兔关节软骨细胞共同植入兔膝关节软骨缺损处，并设对照组。分别于手术后4周、8周观察大体标本以及组织学修复结果，并进行Wakitan的评分，评估此方法的有效性。结果大体观察结果表明，与对照组相比，实验组缺损处由软骨组织修复而对照组缺损处由纤维样组织填充。组织学观察可以见到实验组关节软骨缺损处有密集的软骨细胞而对照组关节缺损处只有纤维细胞无软骨细胞。结论通过短期观察表明以同种异体软骨细胞-去端肽胶原复合物修复全层软骨缺损的方法是有效可行的，为其进一步临床应用提供了参考。     

组织工程肋骨修复胸壁巨大缺损1例

胸壁常因肿瘤、感染和创伤等原因发生大面积缺损 ,迄今尚无理想的硬性胸廓修复材料。 2 0 0 0年 5月 ,我们对 1例巨大复发性左前胸壁瘤样纤维组织增殖症 (韧带状瘤 )施行全层胸壁切除后 ,用组织工程肋骨修复获得成功。病人　女 ,2 5岁。发现左乳下缘固定包块 3年。先后 2次手术切除 ,但均在术后短期内复发且进行性增大。本次入院时包块已增至 18ｃｍ× 18ｃｍ× 18ｃｍ大小 ,坚硬 ,固定于前胸壁 ,侵及左乳房和皮肤。ＣＴ显示包块向深层侵及肋骨、胸膜并突向胸腔内紧贴左上肺和心包。手术切除胸壁全层和第 5～ 9肋骨前段 ,全层胸壁缺损直径约…     

转染人血管内皮生长因子基因的组织工程骨修复眼眶壁骨缺损的实验研究

目的探讨以转染人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)构建的组织工程骨在犬眼眶壁骨缺损中的修复效果。方法体外分离扩增犬自体BMSCs至第2代,用腺病毒转染VEGF基因。采用Real-time PCR和Western Blot检测目的基因和蛋白表达情况。细胞接种在珊瑚支架材料上构建组织工程骨,Elisa检测转基因细胞在支架材料上的蛋白持续表达情况。成年比格犬24只,双侧眼眶内侧壁制造直径12mm圆形骨缺损模型,随机分为4组:A组植入转染VEGF的组织工程骨,B组植入未转染基因的组织工程骨,C组植入单纯珊瑚材料,D组为旷置组。分别在手术后4周、12周、24周取材,行大体观察、Micro-CT分析、免疫组化方法检测血管形成情况,以及组织学观察和组织形态学检测比较骨缺损修复效果。结果VEGF基因修饰的BMSCs能够高表达目的基因和蛋白,构建组织工程骨后能够在体外持续分泌VEGF蛋白22d。C组和D组均未修复眶壁骨缺损。A组在骨缺损修复过程中,4周时的新生血管形成量和新生骨体...     

组织工程方法修复羊腭裂骨缺损的初步研究

目的对羊骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）复合珊瑚修复腭裂骨缺损的可行性进行初步探讨。方法体外培养扩增、成骨诱导羊BMSCs。将第3代细胞复合珊瑚修复羊完全性腭裂骨缺损，以单纯珊瑚植入缺损作为对照组。术后16周头颅CT扫描、大体观察、评价骨缺损的修复效果。结果三维CT显示，实验组可见珊瑚被新生骨替代，对照组可见珊瑚明显降解，裂隙仍然存在。大体观察显示实验组骨缺损基本愈合；对照组中珊瑚明显降解，裂隙仍然存在。结论初步证明羊BMSCs成骨诱导后与珊瑚复合能修复羊腭裂骨缺损。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件,为骨组织工程学研究奠定一定实验基础。方法：取幼年SD大鼠,处死后分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别观察其生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果：大鼠骨髓基质细胞在第7代以前生长形状相对稳定,生长曲线相似;第4d分裂指数最高,为16％;传代后12h贴壁率最高,为90％。结论：本实验方法中,骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

组织工程引导骨再生膜修复节段性骨缺损

目的　将组织工程技术和引导性骨再生技术相结合修复长骨节段性缺损。方法　兔 2 7只 ,动物模型均为桡骨 1 2cm节段性骨 骨膜缺损 ,分成 3组 ,A组 :利用体外构建的细胞 材料复合物膜修复 ;B组 :利用单纯的膜材料进行修复 ;C组 :断端不作任何处置作空白对照。分别观察 3、 6、 12周后进行X线观察和组织学观察。结果　A组的骨愈合优于B组 ,在 12周时已经完成骨缺损的修复 ,B组在术后 12周仍处于塑形改建之中 ;C组 12周形成典型的骨不连。结论　将组织工程的技术与引导性骨再生技术相结合 ,可以比单纯的引导性骨再生更好地修复长骨节段性缺损。     

诱导骨髓基质细胞成血管平滑肌细胞的研究

目的 探讨体外诱导犬骨髓基质细胞(SMSC)为血管平滑肌细胞(VSMC)及其成血管的能力.方法 用含血小板源性生长因子(PDGF-BB)10ìg/L的内皮细胞培养液-2(EGM-2)诱导,无PDGF-BB的EGM-2培养液为对照,检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SM actin)与肌钙结合蛋白(calponin)的表达并接种于聚羟基乙酸(PGA)培养4周后取材.结果 诱导组(n=5)细胞逐步呈平滑肌样转变,表达a-SM actin与calponin,流式细胞仪阳性率分别为(45.16±0.97)%、(37.54 4±1.15)%,可成血管样结构,对照组(n=5)变化不明显,阳性率(7.92±1.04)%、(6.37±0.83)%,成血管样结构能力差.结论 体外可诱导犬BMSC为VSMC并有成血管样结构的能力.     

Development of a New Tissue-Engineered Sheet for Reconstruction of the Stomach

We have developed tissue-engineered digestive tracts composed of collagen scaffold and an inner silicon sheet and successfully used it to repair defects in parts of the esophagus, stomach, and small intestine. However, some improvements were demanded for clinical usage because the silicon sheet presented technical difficulties for suturing and endoscopic removal. New tissue-engineered sheet (New-sheet) was composed of a single-piece and reinforced collagen scaffold with biodegradable copolymer. One beagle dog was used to evaluate whether New-sheet could withstand suturing in comparison with native digestive tracts using a tensile tester. Seven beagle dogs had a 5-cm circular defect created in the stomach. New-sheet soaked with autologous peripheral blood or bone marrow aspirate was sutured to the gastric wall. Endoscopic, histological, and immunohistochemical assessment was performed to evaluate regeneration of the stomach up to 16 weeks. Tensile strength testing showed that the mucosal side of New-sheet had strength almost equivalent to the mucosa of the esophagus ( P  = 0.61). Endoscopically, regeneration of the mucosa started from the circumference after 4 weeks, but a small linear ulcer was still evident at 16 weeks. The regenerated stomach shrank by 60–80% of its original size and histologically showed villous mucosa and underlying dense connective tissue. Immunohistochemically, the regenerated area expressed α-smooth-muscle actin but was negative for basic calponin, irrespective of the source of soaked blood. New-sheet shows sufficient strength for suturing, no dehiscence, and better biocompatibility for clinical use, although further examination will be necessary to create a functional digestive tract.     

以自体诱导和无诱导的骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的比较研究

目的分别采用诱导和无诱导的自体骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）复合珊瑚构建组织工程化骨，修复犬下颌骨节段性缺损，比较修复效果。方法体外扩增、成骨诱导或无诱导培养犬BMSCs，分别将第2代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损（诱导组n=6，无诱导组n=6）。术后32周，分别通过Micro-CT、大体形态观察和组织学方法检测骨缺损的修复效果。结果32周时，Micro-CT检测示诱导组骨容积率和密度均显著高于对照组（P〈0.05）；大体观察示诱导组骨愈合良好，无诱导组中的3条犬为骨不连；组织学检测诱导组有较多成熟骨形成，缺损部分均呈骨性愈合。无诱导组中的3只犬有新骨形成，但形态不完整，另3只犬的缺损部分呈纤维性愈合。结论成骨诱导的自体BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨修复犬下颌骨节段缺损效果优于无诱导组。     

骨髓基质干细胞联合血管束植入构筑血管化组织工程骨

目的 研究兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)联合动静脉血管束植入异种脱蛋白松质骨(xenogeneic deproteinised cancellous bone,XDCB)构筑血管化组织工程骨,为构建组织工程化骨提供新的思路.方法 从兔髂嵴抽骨髓培养制备兔BMSCs,将第3代BMSCs种植于多孔XDCB并进行成骨诱导2周.手术中分离兔隐动、静脉血管束(vascular bundle,VB),以备穿过有孔的XDCB中.取24只新西兰大白兔,其中12只游离双侧兔隐动静脉血管束,共24侧;另外12只兔仅切开股骨外皮肤植入异种骨,共24侧.实验分4组(n=12),A组为单纯材料植入皮下组(XDCB组),B组为干细胞植入材料组(XDCB+ BMSCs组),C组为血管束植入材料组(XDCB+ VB组),D组为干细胞+血管束植入材料组(XDCB+ BMSCs+VB组),各组交叉配对.分别于术后2、4、8周行大体解剖、碱性磷酸酶(ALP)活性检测、茜素红(ARS)染色、组织切片等检查,观察各组移植物血管化情况.结果 D组血管化组织工程骨组可见到血管新生、部分新生骨情况优于B组,也优于C组,而A组的异种骨中未测及相应血管化及成骨效能.结论 BMSCs联合动静脉血管束植入XDCB构筑的血管化组织工程骨有一定的成骨效能,并且可见到材料内部血管化,为构建组织工程化骨提供了新的思路.