Neurogenin1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的:研究neurogenin 1 (Ngn1)转录因子在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,探讨其在ALS转基因鼠发病中的作用.方法:选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各18只,分别于95、108 d和122 d取材,部分鼠经4％多聚甲醛心灌注固定,分离脊髓、制备冷冻切片;部分鼠分离脊髓、提取蛋白和RNA,分别应用免疫荧光显色、免疫印迹和RT-PCR检测Ngnl蛋白及mRNA在ALS转基因鼠发病中的变化.结果:与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Ngnl mRNA和蛋白表达在95、108 d和122 d均降低.免疫荧光实验结果显示,Ngnl阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Ngnl阳性细胞光密度值明显减小.结论:在ALS转基因鼠发病脊髓中Ngnl阳性细胞光密度值明显减少,mRNA和蛋白表达降低,表明Ngnl与ALS的发生密切相关.     

Wnt抑制因子-1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因小鼠中的表达变化

目的 检测Wnt抑制因子-1(Wif-1)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型小鼠脊髓内的表达变化,进一步探讨Wif-1在ALS发病中的作用.方法 选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各54只,分别于鼠龄95d、108d、122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定、分离脊髓、制备冷冻切片,应用免疫荧光染色技术...     

p27在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的:通过观察细胞周期蛋白激酶抑制因子p27在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因鼠脊髓中的表达变化,探讨p27在ALS转基因鼠发病机制中的作用及其意义。方法:选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠,分别于95 d、108 d和122 d取材,分离脊髓,分别应用免疫荧光、免疫荧光双标记和免疫印迹,观察p27的分布和表达变化。结果:与同窝野生型鼠比较,p27蛋白在ALS转基因鼠发病早期(95 d)、中期(108 d)、晚期(122 d)均显著降低。免疫荧光实验结果显示,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠脊髓中p27阳性细胞数量减少,阳性细胞主要为p27/oligo-2双阳性细胞和p27/β-tubulinⅢ双阳性细胞,p27/GFAP双阳性细胞数量较少。结论:在ALS转基因鼠脊髓中p27阳性细胞数量减少,蛋白表达降低,表明p27与ALS的发病密切相关。     

Cyclin D1在肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠大脑皮层和海马中的表达

目的:通过检测细胞周期相关蛋白D1(Cyclin D1)在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因小鼠大脑皮层和海马中的表达变化,探讨Cyclin D1表达改变与ALS发病的关系。方法:选取成年ALS小鼠和同窝野生型小鼠,于发病早、中、晚期(95 d,108 d,122 d)取材,应用免疫荧光技术检测Cyclin D1在大脑皮层和海马的表达规律及与神经元和星形胶质细胞的共定位关系,应用RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA表达情况,应用免疫印迹法检测蛋白表达量的改变。结果:ALS小鼠和野生型小鼠大脑皮层和海马中均可检测到Cyclin D1阳性细胞,且与神经元共表达。在发病早、中、晚期,ALS小鼠大脑皮层中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达较野生型鼠增多(P0.05,P0.01,P0.001);与同窝野生型小鼠相比,ALS小鼠海马中Cyclin D1 mRNA和蛋白在发病的早、中、晚期表达均降低(P0.05,P0.01,P0.001)。Cyclin D1阳性细胞主要分布在海马CA区(包括CA1、CA2和CA3),DG区仅散在表达。结论:Cyclin D1在ALS转基因小鼠大脑皮层和海马中表达异常,表明Cyclin D1调节的细胞周期改变与ALS大脑皮层和海马区病变密切相关。     

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓增殖细胞的分化

目的 探讨成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内增殖细胞的类型及分化情况. 方法 对ALS转基因鼠发病期进行BrdU标记,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光双标及三标染色技术检测ALS转基因鼠病变进展过程中脊髓内增殖细胞的分化情况. 结果 成年ALS转基因鼠发病期脊髓的中央管、灰质、白质均未检测到BrdU/DCX双标记阳性细胞和BrdU/NeuN双标记阳性细胞.灰质、白质和中央管周围检测到大量NG2阳性细胞,阳性细胞数量随病变进展逐渐减少,NG2阳性细胞多呈BrdU阳性表达;可检测到少量BrdU/A2B5双标记阳性细胞;ALS转基因鼠发病期脊髓BrdU/GFAP双标记阳性细胞较多,部分双阳性细胞呈Nestin阳性,而野生型鼠脊髓内未检测到BrdU/GFAP双标记阳性细胞.结论 神经退行性病变激活ALS转基因鼠脊髓内源性增殖细胞向神经胶质细胞方向分化,未检测到向神经元方向分化,内源性增殖细胞尚不能有效地促进退行性病变的修复.     

Notch1在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠动物模型和细胞模型中的表达变化

目的:观察Notch1在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠动物模型和细胞模型中的表达情况。方法:应用免疫荧光、免疫印迹、RT-PCR,检测Notch1在95、108、122 d ALS转基因鼠脊髓中的表达变化;检测转染pEGFP-wt-SOD1和pEGFPG93A-SOD1的NSC34细胞模型中Notch1的表达变化。结果:Notch1可与β-tubulinⅢ共表达,与GFAP无明显共表达。较同窝野生型鼠,Notch1于蛋白水平和mRNA水平上的表达在95 d ALS转基因鼠脊髓中无明显变化,在108 d和122 d ALS转基因鼠脊髓中明显升高;与转染pEGFP-wt-SOD的NSC34细胞相比,转染pEGFP-G93A-SOD1的NSC34细胞中Notch1蛋白和mRNA表达增多。结论:Notch1在ALS转基因鼠动物模型和细胞模型中表达增多,提示Notch1信号通路可能与ALS相关。     

成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓细胞增殖的研究

目的观察成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内源性细胞的增殖和存活情况。方法对ALS转基因鼠进行BrdU注射,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内细胞的增殖、分布和存活情况。结果成年ALS鼠脊髓的中央管、灰质、白质均可检测到BrdU阳性细胞,经常可检测到形状相似、成对出现的细胞。在灰质内,BrdU阳性细胞主要分布于脊髓前角。在白质内,BrdU阳性细胞散在分布。前角ALS鼠脊髓内BrdU阳性细胞数量较野生型鼠多。BrdU末次注射后1d、14d均可检测到BrdU阳性细胞,但细胞数量逐渐减少,28d ALS鼠脊髓内仍可检测到少量BrdU阳性细胞,主要分布于中央管部位。增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致。在95d龄ALS鼠(BrdU末次注射1d后),脊髓中Nestin阳性细胞较野生型鼠多,多数Nestin阳性细胞分布于脊髓前角,某些细胞呈BrdU/Nestin双标阳性。在BrdU注射后14d、28d脊髓中,未检测到BrdU/Nestin双标阳性细胞。结论神经退行性病变可激活ALS转基因鼠脊髓的细胞增殖,且细胞存活可达28d。     

肌萎缩侧索硬化症

肌萎缩侧索硬化症（ALS）的电生理学诊断用的一直都是Lambert的诊断标准（1969），但临床确诊的ALS，初次肌电图检测未必都能完全满足此标准。此后世界神经病学联盟（World Federation of Neurology，WFN）于1990年首报、1994年修订、1998年增加电生理学检查内容后发表了EI Escorial诊断标准（修订版）。     

铁转运相关蛋白在肌萎缩性侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的探讨肌萎缩性侧索硬化症(ALS)转基因鼠脊髓内铁转运相关蛋白表达变化与铁稳态失衡的关联。方法选取h SOD1G93A转基因鼠(ALS鼠)和同窝野生型鼠(WT鼠),分别于生后70、95和122 d分离脊髓,每时间点每组各9只实验动物。Western blotting检测脊髓组织内铁转运蛋白二价金属转运蛋白-1(DMT1)、铁转运蛋白-1(FPN1)及调节蛋白铁调节蛋白-1(IRP1)的表达;免疫荧光双重标记检测脊髓腰段前角内细胞共定位情况。结果 Western blotting显示,与WT鼠比较,各时间点ALS鼠脊髓内DMT1表达均显著降低(P<0.05,P<0.01);70 d FPN1表达升高(P<0.05),95 d和122 d表达下降(P<0.01); 95 d、122 d IRP1表达降低(P<0.01)。免疫荧光双重标记显示,在70 d WT鼠和ALS鼠腰段脊髓中DMT1主要与β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)共表达。与WT组相比,95 d ALS鼠脊髓腰段前角神经元内DMT1免疫反应强,而FPN1荧光强度减弱。随疾病进展,DMT1、FP...     

Wnt11及其受体Fzd5在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓内的表达变化

目的检测Wnt11及其受体Fzd5在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,探讨Wnt11及其受体Fzd5在ALS发病中的作用。方法选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各30只,分别于鼠龄95 d、108d、122 d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定、分离脊髓、冰冻切片,应用免疫荧光技术,检测脊髓中Wnt11及其受体Fzd5的表达变化;部分鼠取出脊髓、匀浆,应用RT-PCR技术检测不同时间点Wnt11及其受体Fzd5 mRNA的表达变化。结果免疫荧光结果显示,与同窝野生型鼠比较,95 d、108 d和122 d龄ALS转基因鼠脊髓中Wnt11阳性细胞明显增多。免疫荧光双标结果显示,Wnt11标记的阳性细胞与GFAP和β-tubulinⅢ共表达,ALS转基因鼠Wnt11/GFAP双阳性细胞增多。与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Wnt11 mRNA水平在95 d、108 d和122 d均升高。Wnt11受体Fzd5表达情况与Wnt11一致。结论 Wnt11和Fzd5在ALS转基因鼠脊髓中表达增多,表明Wnt11及其受体Fzd5表达升高与肌萎缩脊髓侧索硬化症密切相关。     

分泌型卷曲相关蛋白4在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白4(sFRP4)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,及sFRP4在ALS发病中的作用.方法 选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各30只,分别于鼠95d、108d和122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定,分离脊髓和制备冷冻切片,部分鼠分离脊髓,提取RNA和蛋白.分别应用免疫组织化学染色技术、RT-PCR和Western blotting检测sFRP4 mRNA和蛋白水平在不同时间点的变化情况.结果 与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4 mRNA和蛋白表达在95d、108d和122d均升高(P< 0.05).免疫组织化学结果 显示,sFRP4阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角,白质轴突呈阳性反应,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4阳性细胞明显增多.免疫荧光双标结果 显示,sFRP4标记的阳性细胞共表达胶质纤维酸性蛋白和β-tubulin Ⅲ,ALS转基因鼠sFRP4/GFAP双阳性细胞增多.结论 在ALS转基因鼠发病脊髓中sFRP4阳性细胞明显增多,sFRP4 mRNA和蛋白表达升高,表明sFRP4与肌萎缩脊髓侧索硬化症的发生密切相关.     

Immunohistochemical study on choline acetyltransferase in the spinal cord of patients with amyotrophic lateral sclerosis

The authors developed a polyclonal antibody against a fusion protein containing 598 amino acids from a human choline acetyltransferase (ChAT) cDNA and 12 amino acids derived from an expression vector, and examined immunohistochemical reactivity for ChAT in large motor neurons (30 μn and more in somal minimal diameter) of the lumbar spinal cords of four patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and of four control cases. In controls, the number of large neurons included in the tissue with a total thickness of 100 μm ranged from 74 to 105 (average 87). About 60–90% (average 80%) of the neurons were positively stained in their perikarya with an anti-human ChAT antibody. In the cases of ALS, the number of large motor neurons was greatly reduced (25–60, average 38). About 4–13% (average 8%) were positively stained. These results indicate that not only large neurons are reduced in number, but also their positivity for ChAT is decreased in the anterior horn of ALS spinal cord.     

RhoA和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中的表达

目的:通过研究Rho A和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓内的表达变化以阐明Rho/ROCK信号通路在肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中的作用。方法:饲养SOD1-G93A转基因小鼠和同窝野生型小鼠至发病早期、中期和晚期,部分小鼠冰上剥离新鲜脊髓组织,利用RT-PCR方法检测Rho A和ROCK2 mRNA的表达,利用Western Blot方法检测Rho A和ROCK2蛋白的表达;部分小鼠行心脏灌注并剥离其脊髓组织制成冰冻切片,利用免疫组织化学染色方法检测Rho A和ROCK2蛋白的表达。结果:在SOD1-G93A鼠发病的早期、中期和晚期,转基因小鼠脊髓中Rho A和ROCK2的mRNA及蛋白表达均上调。免疫组织化学染色实验结果显示,野生型小鼠脊髓中Rho A和ROCK2弥散分布于胞质和突起中,阳性染色浅,SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中Rho A和ROCK2阳性染色深,大量聚集在细胞膜及细胞质。结论:Rho A和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中异常高水平表达与ALS脊髓区病变密切相关,可能参与ALS疾病进程。     

In vivo diffusion MRI detects early spinal cord axonal pathology in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis

Diffusion magnetic resonance imaging (MRI) exhibits contrast that identifies macro‐ and microstructural changes in neurodegenerative diseases. Previous studies have shown that MR diffusion tensor imaging (DTI) can observe changes in spinal cord white matter in animals and humans affected with symptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The goal of this preclinical work was to investigate the sensitivity of DTI for the detection of signs of tissue damage before symptoms appear. High‐field MRI data were acquired using a 9.4‐T animal scanner to examine the spinal cord of an ALS mouse model at pre‐ and post‐symptomatic stages (days 80 and 120, respectively). The MRI results were validated using yellow fluorescent protein (YFP) via optical microscopy of spinal cord tissue slices collected from the YFP,G93A‐SOD1 mouse strain. DTI maps of diffusion‐weighted imaging (DWI) signal intensity, mean diffusivity (MD), fractional anisotropy (FA), axial diffusivity (AD) and radial diffusivity (RD) were computed for axial slices of the lumbar region of the spinal cord. Significant changes were observed in FA (6.7% decrease, p < 0.01), AD (19.5% decrease, p < 0.01) and RD (16.1% increase, p < 0.001) at postnatal day 80 (P80). These differences were correlated with changes in axonal fluorescence intensity and membrane cellular markers. This study demonstrates the value of DTI as a potential tool to detect the underlying pathological progression associated with ALS, and may accelerate the discovery of therapeutic strategies for patients with this disease.     

Noninvasive detection of brainstem and spinal cord axonal degeneration in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model

Degeneration of motor neurons and their associated axons is a hallmark of amyotrophic lateral sclerosis, but reliable noninvasive lesion detection is lacking. In vivo diffusion tensor imaging was performed to evaluate neurodegeneration in the brainstem and cervical spinal cord of wild-type and G93A-SOD1 transgenic mice, an animal model of amyotrophic lateral sclerosis. A statistically significant reduction in the apparent diffusion coefficient was observed in the motor nuclei VII and XII of G93A-SOD1 transgenic mice relative to wild-type mice. No significant difference in diffusion anisotropy was observed in dorsal white or gray matter in cervical and lumbar segments of the spinal cord. In contrast, statistically significant decreases in axial diffusivity (diffusivity parallel to the axis of the spinal cord) and apparent diffusion coefficient were found in the ventrolateral white matter of G93A-SOD1 mice in both the cervical and lumbar spinal cord. The reduction in axial diffusivity, suggestive of axonal injury, in the white matter of the spinal cord of G93A-SOD1 mice was verified by immunostaining with nonphosphorylated neurofilament. The present study demonstrates that in vivo diffusion tensor imaging-derived axial diffusivity may be used to accurately evaluate axonal degeneration in an animal model of amyotrophic lateral sclerosis.