恶性疟原虫体外短期无血清培养上清可溶性抗原的纯化和分析

本实验对恶性疟原虫(FCC—1/HN)裂殖体体外短期无血清培养上清可溶性抗原进行了纯化,并用CIE及ELISA法检测和分析上清可溶性抗原的免疫学活性.结果表明,恶性疟原虫体外短期无血清培养上清中有可溶性抗原存在,抗原特异性与恶性疟原虫虫体抗原相似:经亲和层析纯化的上清抗原中不含可测水平的红细胞膜抗原成分.     

5株抗恶性疟McAb的免疫荧光特性及其靶抗原鉴定

本文观察了5株抗恶性疟McAb的免疫荧光特性,并对其抗原进行了鉴定。结果表明5株McAb主要与恶性疟原虫红内期发育晚期虫体的表面膜抗原发生免疫反应,免疫荧光图象为明亮的点状、均匀片状和蜂窝状。它们在对靶抗原的识别上与免疫荧光的特点呈现一致性,主要能识别恶性疟原虫红内期发育晚期虫体的~(125)Ⅰ-表面标记抗原,其中McAbs 93A_3、94B_5、92D_4和93D_4主要识别分子量为125、115、83、74和67KDa的表面抗原,而McAb94D_1则主要识别分子量为200和19KDa的抗原。     

三株抗恶性疟原虫抑制性单克隆抗体的鉴定

M26-32,是可与不同种人疟及不同种地区恶性疟原虫分离株的红内期发生广泛交叉反应的McAb,(NH_4)_2SO_4提纯的M26-32 100μg/ml可阻断裂殖子入侵红细胞42.8％,50μg/ml可抑制P.f.生长71.2％;可沉淀145、135、102及76kd的恶性疟原虫蛋白;F_6-D_3是抗裂殖子表面抗原的McAb,50μg/ml可阻断76.7％裂殖子入侵红细胞,同一浓度可抑制P.f.生长的44.6％,其抗原分子为185kd蛋白;F_6-C_2是针对裂殖子一端某一结构的MeAb,200μg/ml时,可阻断52.9％裂殖子入侵红细胞,可免疫沉淀82及41kd的蛋白。     

单克隆抗体免疫亲和层析一步法纯化癌胚抗原

本文用特异性抗癌胚抗原的单克隆抗体,经与CNBr—Sepha?ose4B偶联,以100mmol/L二乙胺pH11.5洗脱亲和层析柱,一步法从NP—40可溶性的大肠腺癌组织提取物中纯化癌胚抗原。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-Blotting鉴定了抗原纯度及活性。以微量固相免疫放射试验检测了抗原活性。     

热应激蛋白70kd家族的纯化及鉴定

人白血病胸腔渗出细胞(K_(652))经热应激后诱导产生的热应激蛋白经DEAE-52阴离子交换层析,ATP-琼脂糖亲和层析,纯化出73kd、72kd和65kd的成分。用免疫印迹技术证明所纯化的蛋白质能与热应激蛋白70kd家族单克隆抗体发生特异性识别反应。此法所纯化的蛋白共有3种,其分子量分别为73kd、72kd和65kd。     

与人胃癌反应的单克隆抗体GL—013

应用B-细胞杂交瘤技术,以胃癌转移淋巴结中的癌细胞为免疫原,经ABC-免疫组织化学方法筛选,研制出一种鼠单克隆抗体GL-013。免疫亲和层析纯化抗原,Western Blot鉴定抗原分子量约大于200kd的糖蛋白,抗原对1%过碘酸处理敏感,与CEA、NCA和血型前体Lewisy抗原不相关。免疫组化研究表明抗体与胃癌有较高的特异性,抗原的表达与转移相关。     

抗斯氏狸殖吸虫单克隆抗体识别和检测抗原分子量

作者用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离斯氏狸殖吸虫抗原,并通过转移电泳转至国产混合纤维素酯滤膜上,用特异单克隆抗体进行识别,检测识别的抗原区带的分子量。制备的三株单克隆抗体(A_6、D_(10)、E_9)共识别6条抗原区带,抗原的分子量分别为182、152、109、21、17.8和14.5kd。     

抗恶性疟McAb的筛选与恶性疟免疫诊断研究

用单克隆抗体(McAb)夹心斑点免疫金银染色法(Dot-IGSSA)对11株抗恶性疟McAbs和4株抗食蟹猴疟原虫McAbs进行了筛选,其中McAbs11G5、13A2、13A1可包被到硝酸纤维素膜(NcF)上作为捕获抗体,McAb14D9可用于胶体金探针的标记。此外,为增加胶体金的标记效果和胶体金标记McAb14D9探针的敏感性,还对McAb14D9的等电点(pI)进行了测定,其pI为6.35。同时用筛选出的最佳McAbs对10份恶性疟病人感染血和10份健康人血样品进行了检测,并对这几株McAbs的交叉反应性进行了测定,结果表明McAbs11G5、13A1与14D9夹心时,对云南株和安微株恶性疟原虫红内期抗原呈现交叉反应,而且McAb13A1与14D9夹心时还可以用于检测间日疟抗原。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

Purification and Analysis of Soluble Antigens in Short Term Serum-Free in vitro Culture Medium of Plasmodium Falciparum

Supernatants collected from the short term in vitro serum-free cultures ofPlasmodium falciparum (Pf) schizont-infected erythrocytes were detected and analysed bycounterimmuno-electrophoresis (CIE) and enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA).Soluble antigens were purified from the supernatants by immunoabsorbent chroma-tography. It was found that soluble antigens similar to the sonicated Pf antigens inimmunospecificity were present in the supernatants and no erythrocyte membrane antigenswere detectable in the affinity-purified supernatant antigens (Ps-Ag).     

弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定

目的 应用单克隆抗体免疫亲和层析技术提纯弓形虫主要表膜Ｐ３０抗原并进行鉴定。方法 将我们已建立的分泌抗表膜Ｐ３０抗原单克隆抗体的Ｅ３杂交瘤细胞注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔,收集腹水,用饱和硫酸胺沉淀和ＤＥＡＥ－－纤维柱层析法提纯单克隆抗体,将其偶联至溴化氢活化的琼脂糖４Ｂ上装柱,经免疫亲和层析技术,从大量的低功率超声粉碎速殖子抗原中分离纯化Ｐ３０蛋白质,并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行鉴定。结果 本次实验约获得了８．１ｍｇ的Ｐ３０蛋白质,且纯度较高。结论 单克隆抗体免疫亲和层析技术可获得一定量的Ｐ３０抗原。     

人类肿瘤相关蛋白hyrdC的原核表达、抗体制备及其在胃癌中的初步检测

目的:制备原核表达的hyrdC纯化蛋白及相应单克隆抗体,并以该抗体初步检测胃癌中hyrdC蛋白的表达.方法:用RT-PCR方法获取人hyrdC基因序列,插入原核表达载体pET32a构建重组质粒,纯化得到TRX-hyrdC融合蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备抗hyrdC单克隆抗体,以ELISA、Western印迹法筛选及鉴定;采用免疫组织化学法(SP法)比较胃癌组织及瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平的差异.结果:测序结果显示克隆的hyrdC ORF与GenBank中登录的序列一致.所获TRX-hyrdC融合蛋白相对分子质量与理论计算值相符,获得2株分泌抗hyrdC单克隆抗体的细胞株;Western印迹法显示该抗体能特异性地结合人hyrdC蛋白;SP法测定显示,hyrdC蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常胃组织(P＜0.001).结论:成功制备了抗hyrdC单克隆抗体;SP法测定胃癌组织与瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平有显著差异.     

Preparation and Identification of Rat Monoclonal Anti-idiotope Antibody to the Antibody against Erythrocytic Stages of Plasmodium Falciparum

A hybridoma cell line secreting monoclonal antibody to idiotope of the monoclonalantibody 94D1 specific for asexual erythrocytic stages of Plasmodium falciparum was established byfusion of SP2/0 mouse myeloma cells with spleen cells of Wistar rats immunized with monoclonalIgG of 94D1 purified from ascitic fluid of BALB/C mouse by affinity chromatography on ProteinA- Sepharose CL- 4B. Specificity of the anti - idiotope antibody (anti - Id), 41RF5, was deter-mined with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showedthat 41RF5 reacted only with 94D1 IgG2b, not with normal mouse IgG and other seven mousemonoclonal antibodies - five specific for erythrocytic stages of P. falciparum, one for erythrocyticstages of P. inui, and one for Dengue fever virus type III, which indicates that 41RF5 does recognizespecifically the idiotope of 94D1 monoclonal antibody. In 41RF5 heterohybrid culture supernatant,anti-Id titre measured by ELISA was above 1:1 280. Up to the present, the heterohybrid cell linehas been cultured stably for 16 months.     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

抗恶性疟单抗独特型决定簇之第二单克隆抗体的制备和鉴定

以分泌抗恶性疟红内期抗体的小鼠杂交瘤细胞系94D1诱生的腹水,通过Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化IgG,并以此作为免疫原皮下多点免疫Wistar大鼠。加强免疫后3天取脾与小鼠SP~2/0瘤细胞进行异种间的细胞融合,经间接ELISA法检测筛选和5次克隆化,最终得到一株生长稳定、连续分泌特异抗体的异种杂交瘤细胞系41RF5。经过多次冷冻和复苏以及体外连续传代培养16个月,其稳定性与小鼠×小鼠杂交瘤细胞相近。选择8株单抗和SP2/0IgG作为包被抗原,用间接ELISA法对41RF5特异性进行鉴定.结果显示,41RF5单抗只与94D1呈阳性反应,与其余各种包被抗原均呈阴性反应,表明41RF5具有良好的抗94D1单抗独特型决定簇的特异性。41RF5培养上清中特异的抗体效价为1:1280。     

恶性疟原虫单克隆抗体保护性机制的实验研究

用体外抑制试验、调理试验和细胞毒试验等方法,对抗恶性疟原虫红内期McAb之功能特性进行了研究。17株McAb中有7株对同步化培养的恶性疟原虫的体外增殖具有明显的抑制作用;抑制强度取决于剂量和作用时间。在McAb—IgG浓度为0.6mg/ml时,上述7株McAb的抑制活性均在94％以上。在6株McAb中,有4株能促进巨噬细胞吞噬疟原虫而发挥调理作用。在7株McAb中,有4株能加强腹腔细胞杀伤和杀死疟原虫而表现出细胞毒活性。结果提示,恶性疟原虫McAb似有“多功能”、“双功能”和”单功能”之分,用“多功能性McAb”纯化的疟疾抗原,在制备疟疾亚单位疫苗方面可能更有意义。     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

小鼠H—2抗原的提取与纯化

This study was designed to purify the mouse major histocompatibility complex antigen (H-2Ag). The detergent was used to extract the crude H-2Ag, and monoclonal antibodies affinity chromatography was applied to purify H-2 antigen. A 45 kd heavy chain and a 12 kd light chain from the purified proteins were shown by electrophoresis. Besides, the pure H-2 antigen was found to have immunological and biological activity. This method should be useful in purifying large quantities of H-2Ag for the researches in transplantation and functional analysis of H-2 antigen.