盐酸小檗碱、黄芩苷和苦参碱对SZ95皮脂腺细胞增殖及脂质合成的影响

目的 研究中药单体盐酸小檗碱、黄芩苷和苦参碱对永生化人皮脂腺细胞(SZ95)增殖及脂质合成的影响.方法 倒置显微镜观察药物作用24h后细胞形态变化.确定药物的毒性浓度;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的药物在作用24、48及72h对SZ95细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测药物作用48h后尼罗红染色的SZ95细胞内脂质含量的变化.结果 毒性浓度黄芩苷为1×10^-3mol/L,盐酸小檗碱为1×10^-4mol/L,苦参碱在1×10^-3mol/L以下细胞未见形态变化.MTT法显示,盐酸小檗碱呈时间和剂量依赖性抑制SZ95细胞的增殖,IC50值48h为2.9×10^-5mol/L,72h为1.4×10^-5mol/L;黄芩苷在5×10^-4mol/L以下、苦参碱在1×10^-3mol/L以下对SZ95细胞增殖无影响.1×10^-4mol/L儿黄芩苷作用48h使细胞平均荧光强度下降30.1%(P<0.05);1×10^-6mol/L盐酸小檗碱下降7.9%,但差异无统计学意义(P>0.05);1×10^-3mol/L苦参碱则促进脂质合成(26.9%).结论 盐酸小檗碱、黄芩苷等中药单体可能具有抑制皮脂腺细胞增殖或脂质合成的作用.     

盐酸小檗碱对红色毛癣菌形态学的影响

目的观察红色毛癣菌在盐酸小檗碱作用下形态学变化。方法应用美国CLSI制订的标准M38-A方案,采用MTT微量稀释法测定盐酸小檗碱对红色毛癣菌的体外抑制率。将盐酸小檗碱作用前后的红色毛癣菌制成标本,分别在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察形态学变化。结果盐酸小檗碱作用于红色毛癣菌后,扫描电子显微镜下菌丝表面变粗糙,菌丝萎缩、皱瘪、粗细不一,出现多处破损、断裂和小的破坏性孔洞。透射电子显微镜下细胞变形,呈不规则形;细胞壁粗糙,厚薄不均;细胞浆结构模糊,细胞核凝固、破碎。结论盐酸小檗碱使红色毛癣菌的形态发生明显变化。     

小檗碱对皮肤鳞状细胞癌裸鼠模型的抑制作用及其机制研究

【摘要】 目的 研究小檗碱对皮肤鳞状细胞癌（cSCC）-A431裸鼠移植瘤的体积、重量、细胞增殖及凋亡的影响，探索小檗碱抑制cSCC的可能机制。方法 培养A431细胞，于20只裸鼠背部皮下注射A431细胞悬液建立cSCC移植瘤裸鼠模型。接种第15天，将荷瘤裸鼠随机平均分为4组：低、中、高剂量组裸鼠腹腔分别注射10、20、25 mg/kg小檗碱溶液，对照组腹腔注射生理氯化钠溶液，每日1次，连续给药35 d。分别于给药前、给药第7、14、21、28、35天检测移植瘤体积。实验结束后，处死裸鼠并随即剥离瘤块称重，计算肿瘤生长抑制率。移植瘤行组织病理检查，免疫组化检测Ki67表达水平，TUNNEL染色检测移植瘤组织中凋亡细胞数，荧光定量PCR和Western印迹法分别检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和Ezrin mRNA和蛋白的表达。多组间比较采用单因素方差分析，各组与对照组比较采用Dunnett-t检验。结果 随小檗碱剂量升高和作用时间延长，肿瘤生长曲线逐渐变平缓，各小檗碱组肿瘤生长受到不同程度的抑制，其中高剂量组肿瘤生长抑制作用最明显。小檗碱低、中、高剂量组肿瘤生长抑制率分别为31.05%、66.68%、76.49%，瘤重均显著低于对照组（t = 4.07、6.33、7.26，均P < 0.01）。移植瘤组织病理检查显示，随小檗碱剂量的增加，肿瘤细胞坏死程度和范围增加。免疫组化显示，随小檗碱剂量的增加，Ki67阳性细胞逐渐减少。此外，低、中、高剂量组Ki67阳性细胞数均显著低于对照组（均P < 0.01），而凋亡细胞数均显著高于对照组（P < 0.05或 < 0.01）。4组Bax、Bcl-2、caspase-3、Ezrin mRNA及蛋白表达差异均有统计学意义（均P < 0.01）。其中，小檗碱低、中、高剂量组Bcl-2 mRNA的表达均显著低于对照组（均P < 0.01），中、高剂量组Bcl-2蛋白表达显著低于对照组（均P < 0.01）；高剂量组Bax mRNA及中、高剂量组caspase-3 mRNA的表达均显著高于对照组（P < 0.05或 < 0.01），而低、中、高剂量组Bax、caspase-3蛋白表达量均显著高于对照组（均P < 0.01）；仅高剂量组Ezrin mRNA表达显著高于对照组（均P < 0.01），而低、中、高剂量组Ezrin蛋白表达均显著低于对照组（均P < 0.01）。结论 小檗碱可抑制cSCC-A431裸鼠移植瘤细胞的增殖并促进凋亡，从而一定程度抑制cSCC-A431裸鼠移植瘤的生长，其机制可能与小檗碱上调Bax、caspase-3的表达，同时下调Bcl-2、Ezrin的表达有关。     

凝集性生长和非凝集性生长人毛乳头细胞线粒体的结构及膜电位比较

目的比较凝集性生长和非凝集性生长人毛囊毛乳头细胞(DPC)的线粒体数量、分布、结构和功能特点。方法采用二步酶消化法分离人毛囊毛乳头后,体外培养DPC。利用还原型线粒体特异性荧光探针MitoTrackerRedCM-H2Xros,结合激光扫描共聚焦显微镜和透射电镜观察两种不同生长状态DPC线粒体的分布、数量及结构特征;利用四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)检测线粒体膜电位。结果体外培养DPC生长良好;与非凝集性生长DPC相比,凝集性生长DPC线粒体数量较多,整个胞浆内可见,且集中分布在粗面内质网附近,线粒体外形较不规则,嵴较发达,线粒体膜电位明显较高。结论凝集性生长DPC和非凝集性生长DPC的线粒体数量、分布、结构和功能不同,说明两者在能量消耗、细胞代谢及蛋白质合成功能方面存在差异。     

盐酸小檗碱和黄芩苷对SZ95人皮脂腺细胞内I型5α-还原酶mRNA表达的影响

目的: 评价盐酸小檗碱和黄芩苷对永生化SZ95人皮脂腺细胞内I型5α-还原酶mRNA表达的影响.方法: 盐酸小檗碱和黄芩苷作用SZ95皮脂腺细胞24 h后,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞内I型5α-还原酶mRNA的表达.结果: 1×10-5 M盐酸小檗碱明显下调5α-还原酶mRNA的表达(P<0.05).结论: 盐酸小檗碱可能具有通过抑制I型5α-还原酶的表达拮抗双氢睾酮(DHT)对人皮脂腺细胞活性的刺激作用.     

小檗碱衍生物HB-13对角质形成细胞分泌IFN-γ的影响

目的研究小檗碱衍生物HB一13对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）分泌γ干扰素（IFN叫）的影响,探讨HB-13的抗炎机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝法确定HB-13作用于HaCaT细胞的安全浓度;细胞经P物质刺激后,加入不同浓度的HB-13分别孵育12、24、48h,应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清液中IFN-γ的含量,应用实时荧光定量PCR法检测细胞内IFN-γmRNA表达情况。结果HB-13浓度为2．5、5、10μg／ml对HaCaT细胞毒性作用不显著,并可促进P物质诱导的IFN-γ的分泌。结论促进表皮细胞分泌IFN-γ可能是HB-13在皮肤局部发挥抗炎作用的机制之一。     

小檗碱对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨小檗碱对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖及凋亡相关信号通路中Bax与Bcl-2表达的影响.方法 体外培养A431细胞,分别用含12.5、25、50、100 mg/L小檗碱的培养液（实验组）、含250 mg/L顺铂的培养液（阳性对照组）、正常培养液（空白对照组）作用于A431细胞12、24、48、72 h后,用噻唑蓝（MTT）法测定小檗碱对A431细胞生长的抑制作用;倒置显微镜观察小檗碱作用后细胞形态学改变;实时定量RT-PCR法检测小檗碱对A431细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响;免疫荧光法分析Bax和Bcl-2的表达情况.采用SPSS 13.0软件进行多因素方差分析.结果 MTT结果显示,小檗碱对A431细胞的生长抑制作用随作用时间的延长而增强（F=510.927,P〈0.001）,随浓度的增加而增强（F=1118.312,P＜ 0.001）,小檗碱浓度与作用时间的交互作用有统计学意义（F=70.239,P＜ 0.001）,表明不同浓度小檗碱组各时间点的变化趋势不完全一致.倒置显微镜下可见,随着药物浓度增加,A431细胞密度减少,由多角形变为圆顿皱缩.实时定量RT-PCR结果表明,小檗碱作用后,随着时间或浓度的增加,Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量增加,同一浓度小檗碱（25、50、100 mg/L）作用4、8、12h组间比较,差异均有统计学意义（F=226.231、1 300.636、4 325.139,P＜ 0.001）.免疫荧光染色显示,小檗碱作用后A431细胞内Bax荧光增强,而Bcl-2减弱.结论 小檗碱对A431细胞的生长抑制作用呈时间和浓度依赖性,Bax和Bcl-2的表达改变可能是小檗碱诱导A431细胞凋亡的途径之一.     

盐酸小檗碱联合抗真菌药物对红色毛癣菌的体外药敏实验

目的观察盐酸小檗碱联合不同浓度抗真菌药物对红色毛癣菌的体外抗菌活性。方法参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)颁布的M38-A2方案和相关文献对临床分离的30株红色毛癣菌进行体外药敏实验。其中盐酸小檗碱的MIC值定义为与生长对照相比,肉眼观察出现80%生长抑制的最低药物浓度。采用分数抑菌浓度(FIC)评定两药联合效果。FIC≤0.5,两药为协同作用;0.54,两药为拮抗作用。结果盐酸小檗碱和不同浓度伊曲康唑联合,主要为无关作用。盐酸小檗碱和不同浓度特比奈芬、伏立康唑联合,均为拮抗作用。16.0μg/mL氟康唑组与盐酸小檗碱联合时FIC≤0.5所占比例为83.33%,协同作用最强;2.0～8.0μg/mL卡泊芬净组与盐酸小檗碱联合时,FIC≤0.5所占比例最高,均为63.33%,协同作用最强,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论盐酸小檗碱与高浓度氟康唑、卡泊芬净联合,体外对红色毛癣菌有较强的协同作用。     

HaCaT细胞对红色毛癣菌生长的抑制作用

目的 探讨角质形成细胞对红色毛癣菌生长的抑制作用.方法 将HaCaT细胞采用含10%小牛血清的DMEM培养液,5%CO2环境下,37 ℃孵育至80%融合时,弃去培养液,加入用无血清DMEM配制的菌丝段悬液共孵育(浓度0.1×105/mL～1.0×105/mL),并以菌丝段悬液作为阴性对照.分别于4 h、8 h、16 h和24 h制备共孵育后的菌丝段悬液,进行台盼蓝染色计数和菌落计数,对真菌生长状况进行评价并计算真菌生长抑制率.结果 在细胞和菌丝段共孵育4 h、8 h、16 h和24 h,台盼蓝染色法测得的菌生长抑制百分数分别为46.8%±8.0%、64.0%±5.5%、76.3%±7.7%和39.5%±4.9%;菌落计数法测得菌生长抑制百分数分别为39.7%±4.9%、58.0%±8.9%、68.3%±7.4%和39.9%±5.5%.结论 HaCaT细胞对体外培养的红色毛癣菌有一定的抑制作用.     

三尖杉酯碱对表皮角化及细胞有丝分裂的影响

已知有二类治疗肿瘤药物对银屑病有效,一类是有抑制肿瘤细胞作用的药物,如氨甲喋呤[1]、氮芥等,另一类是肿瘤细胞分化诱导剂,如维甲酸类。三尖杉酯碱具有抑制肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞分化作用的双重特性[2,3]。我们曾试用于治疗银屑病,获得较好疗效[4]。本文通过观察三尖杉酯碱对鼠尾鳞片表皮的颗粒层形成作用和对鼠阴道上皮细胞有丝分裂的抑制作用,探讨三尖杉酯碱治疗银屑病的机理。材料与方法动物　由镇江医学院动物室提供,20～25g昆明种小鼠,每组10只。药物与试剂:三尖杉酯碱由常州健民制药厂提供,氮酮购自重庆华帮制药有限公司。一、对表…     

中波紫外线辐射剂量与HaCaT细胞凋亡时相的相关性研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射角质形成细胞后,UVB辐射剂量与角质形成细胞凋亡时相的相关性。方法 以20,40,60,80,100和120mJ/cm²的UVB辐射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,检测辐射后2,12,24,48和72h的细胞活性和细胞周期的变化,以及代表不同时相的凋亡通路:即应用广谱Caspase抑制剂VAD-FMK与凋亡细胞中活化的Caspase不可逆的结合检测早期Caspase介导的凋亡;应用AnnexinV及PI双染方法检测后发的细胞膜介导的凋亡;以及应用DNA的梯度凝胶电泳检测晚期细胞核介导的凋亡。结果 UVB辐射可使HaCaT细胞的细胞周期受滞于G2/M期,G2/M期的百分比与辐射剂量成正比。细胞活性于24h后与辐射剂量成反比。各时相的凋亡率均与辐射剂量成正比,但凋亡通路有明显的时相性:即早期(48h内)由Caspase和细胞膜介导凋亡为主,晚期(48h后)则由细胞核介导凋亡为主。结论 UVB诱导的角质形成细胞凋亡具有显著的剂量与时相依赖性特征。宜对其进行多指标、多时相的检测。     

血管内皮细胞生长因子真核表达载体在HaCaT细胞中的表达

目的 探讨外源性人vEGF₁₆₅基因在HacaT细胞中表达的可行性及其对体外培养的猪毛囊的影响。方法 通过脂质体将与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因共表达的血管内皮细胞生长因子(vEGF)真核表达载体PIRES₂-GFP-vEGF₁₆₅。瞬时转染HaCaT细胞,应用激光共聚焦显微镜观察EGFF在HaCaT细胞内的表达,同时利用ELISA法检测vEGF在培养细胞被转染的上清液中的表达。进一步将该上清液加至体外培养的猪毛囊中,显微镜下测量毛囊的平均生长长度,并观察毛囊的形态学变化。结果 成功地将vEGF真核表达载体PIRES厂EGFP一vEGF₁₆₅瞬时转染了HacaT细胞,以激光共聚焦显微镜观察可见细胞内EGFP的表达,同时用ELIsA法证实了上清液中vEGF呈高水平表达,并且该上清液可以明显促进体外培养的猪毛囊生长,延缓其进人退行期。结论 应用脂质体能够成功地将外源性人vEGF₁₆₅基因转染HaCaT细胞,并进行有效表达,其表达的vEGF在体外具有促进猪毛囊生长的生物学活性。     

毛乳头细胞高效培养方法探索

显微解剖法分离毛乳头效率低，细胞生长差，采用胶原酶Ｄ消化法直接将毛囊下部的真皮鞘组织消化成真皮鞘细胞和毛乳头，从而省去了在解剖显微镜下分离毛乳头的步骤，显著减少了工作量，提高了效率，而且极大地促进了毛乳头的贴壁和细胞的生长，并保证了毛乳头的完整性，且可大批量分离出毛乳头，组织化学染色表明毛乳头细胞是一种高度特异的成纤维型细胞     

鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨天然植物鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞系增殖及分化的影响。方法 将培养的HaCaT细胞分为鳄梨油组、橄榄油组及对照组。应用MTT实验确定鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞的适用剂量。以免疫细胞化学、免疫斑点印迹技术分别检测各组HaCaT细胞的c-myc原癌基因（c-myc）、有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10的表达。结果 对照组c-myc、MAPK、NF-κB免疫化学反应的扫描灰度均值（GSM）分别为101.9 ± 8.9、91.4 ± 5.1、94.3 ± 7.0,鳄梨油组分别为131.4 ± 6.6、136.3 ± 4.5、134.3 ± 5.2,与对照组比较均显著增加（P < 0.05）;橄榄油组分别为121.1 ± 4.5、107.9 ± 7.3、106.4 ± 5.4,与对照组比较均亦显著增加（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,前者各项GSM均高于后者（P < 0.05）。鳄梨油组和橄榄油组丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10免疫化学反应的GSM均高于对照组（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,后者均高于前者（P < 0.05）。此外,各组各项免疫斑点印迹的GSM与免疫细胞化学的GSM数据基本相符,在鳄梨油组两者呈显著正相关,r = 0.94,P < 0.01;在橄榄油组两者也呈现显著正相关,r = 0.97,P < 0.01。结论 一定浓度鳄梨油和橄榄油,尤其是鳄梨油对HaCaT细胞可呈现显著的促生长、增殖效应;橄榄油和鳄梨油,尤其橄榄油对HaCaT细胞可呈现显著的促分化效应。     

阿维A对人表皮鳞状细胞癌A431细胞株生长及凋亡的影响

目的 研究阿维A对上皮鳞状细胞癌(鳞癌)细胞生长的影响及其诱导凋亡作用。方法 以体外培养的人表皮鳞癌细胞A431细胞和角质形成细胞HaCaT细胞为研究对象,用MTT法观察阿维A对A431细胞和HaCaT细胞的生长抑制作用,用光镜和电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测凋亡峰的出现,Annexin-V染色证实凋亡的发生。结果 随着阿维A作用时间的延长及剂量的增加,对A431细胞增殖的抑制作用增加。同样浓度和同样作用时间的阿维A对A431细胞增殖的抑制率高于对HaCaT细胞的抑制率。光镜和电镜观察显示随阿维A作用时间延长,A431凋亡细胞增多。流式细胞仪检测显示随阿维A作用时间的延长,亚G1期凋亡峰明显增加,Annexin-V染色阳性细胞数增多。结论 阿维A具有抗上皮鳞癌细胞生长及诱导上皮鳞癌细胞凋亡作用。     

芦荟甙对中波紫外线辐射HaCaT细胞表达诱导型一氧化氮合酶及核因子κB的影响

目的 探讨芦荟甙对中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞诱导核因子kB(NF-KB)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的抑制作用。方法 采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖变化,生化比色法检测培养细胞上清液中NO含量,RT-PCR法检测HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达变化,免疫荧光细胞化学染色测定NF-kB P65的激活表达。结果 30 mJ/cm² UVB辐射HaCaT细胞,细胞的增殖明显下降,NO的合成分泌增加,iNOS mRNA表达显著增加,同时NF-kB被激活,从细胞浆易位到细胞核。芦荟甙对HaCaT细胞的增殖有显著促进作用。用不同浓度芦荟甙预处理HaCaT细胞,可以显著抑制UVB辐射诱导的NF-kB激活,下调iNOS mRNA表达及NO合成分泌。经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 芦荟甙通过抑制UVB辐射诱导的NF-kB P65激活,下调iNOS mRNA表达,减少NO合成分泌,发挥防护紫外线辐射损伤的作用,在炎症性皮肤病防治中可能发挥重要作用。