急性肾损伤微环境上调骨髓间充质干细胞分泌肾脏保护性生长因子

目的：急性肾损伤的模型中不可忽视炎症等原因,机体在不同应激反应条件下分泌的保护性生长因子各不相同。在这种情况下,骨髓间充质干细胞分泌的肾脏保护性细胞因子不同于急性肾脏损伤的炎症因子。因此,探讨在体外模拟的急性肾衰竭微环境中上调骨髓间充质干细胞（BMSC）肾脏保护性生长因子的可能性。方法：取SD大鼠的骨髓细胞,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取的细胞经流式细胞仪鉴定为BMSC,分别用含有胎牛血清（对照组）;胎牛血清＋缺血再灌注肾脏匀浆上清的培养基进行培养实验。培养7d后,RT—PCR检测两组BMP-7、IL-10、HGF的mRNA表达情况并进行比较。结果：培养7d后,体外模拟的急性肾衰竭微环境组BMP-7、IL-10、HGF的mRNA表达高于对照组。结论：在体外模拟的急性肾衰竭微环境中上调BMSC肾脏保护性生长因子的表达,从而对急性肾损伤发挥主要修复作用。     

转化生长因子-β1和血清对人骨髓基质干细胞增殖及向软骨细胞诱导分化的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和不同浓度胎牛血清对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖及向软骨细胞诱导分化的作用,为软骨组织工程提供有用的种子细胞。方法分别采集3例志愿者骨髓各6mL,用Percoll细胞分离液分离,收集单个核细胞,在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养扩增。将第3代细胞分为3组:A组为对照组,B组为含5%胎牛血清的诱导培养基组,C组为含10%胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌,原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达,3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况。结果经密度梯度离心后,活细胞比例在96%以上。贴壁后的细胞形态均一,由梭形向多角形转变。B组细胞在诱导培养7d后Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,原位杂交可检测到Ⅱ型胶原mRNA的表达,而A、C两组分别为阴性和弱阳性。三组细胞3H-TdR摄入量的大小顺序为C>B>A。结论密度梯度离心法是一种高效、可大量获取人BMSCs的方法,细胞在体外生长稳定;低浓度的胎牛血清和10ng/mL的TGF-β1联合作用既可促进人BMSCs的增殖,又可诱导其向软骨细胞方向分化,而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用。     

Notch1/Hes1信号通路在高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的:评价缺刻基因1(Notch1)/发状分裂相关增强子1(Hes1)信号通路在高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法:取H9c2心肌细胞在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养、传代,采用随机数字表法分为6组( n＝12)：对照组(C组)用低糖培养基孵育72 h;缺氧复氧组(H/R组)用低糖培养基孵育...     

红细胞生成素对高糖诱导肾小管细胞凋亡的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）是否可以抑制高糖诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡及其相关机制。 方法 传代培养大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）,分为正常对照组（NC组）、渗透浓度对照组（OC组）、高糖组（HG组）、高糖+EPO 50 U/ml组（E1组）和高糖+EPO 100 U/ml组（E2组）。免疫荧光检测NRK-52E细胞有无EPO受体（EPOR）表达。Western印迹检测高糖对EPOR表达的影响。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡指数。荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）的水平。RT-PCR检测bcl-2、bax、capases-3 mRNA的表达。 结果 （1）NRK-52E细胞表达EPOR,且高糖可刺激EPOR表达增加。（2）高糖可诱导NRK-52E细胞凋亡,与葡萄糖相同渗透浓度的甘露醇不能明显诱导细胞凋亡。E1、E2组细胞早、晚期凋亡率显著低于HG组（P < 0.05）。（3）高糖刺激 NRK-52E细胞后,细胞内ROS产生增多,bcl-2 mRNA的表达下调,bax、caspase-3 mRNA的表达上调。EPO可以抑制细胞内ROS的产生,上调bcl-2 mRNA 表达,下调bax、caspase-3 mRNA 表达。 结论 EPO可能通过EPOR的介导,缓解高糖诱导的氧化应激,上调bcl-2 mRNA表达,下调bax、caspase-3 mRNA表达,抑制NRK-52E细胞凋亡。     

重组人促红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖

目的 观察重组人促红细胞生成素(rhEPO)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响,并探讨其可能机制.方法 抽取健康志愿者的骨髓液,采用贴壁培养法获取第3代MSCs(P3-MSCs),通过细胞形态特征观察、细胞免疫表型检测以及诱导分化的方法 鉴定MSCs.取经过鉴定的P3-MSCs,分别与不同浓度(0.5、1、5、10、50 IU/ml)rhEPO共培养,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖;以过量特异性抗体封闭EPO受体(EPOR),再用MTT法观察P3-MSCs增殖情况;采用免疫荧光细胞化学染色法检测P3-MSCs的EPOR表达,用Western印迹检测增殖信号通路蛋白表达.结果 贴壁培养获取的P3-MSCs同时高表达CD105和CD90,低表达CD34和CD45,并可被诱导分化为脂肪、成骨及软骨细胞.MTT结果 显示,给予EPO后,MSCs的增殖明显增强,以浓度为10 IU/ml者的作用最为显著;同时加入抗EPOR抗体封闭EPOR后,MSCs的增殖率明显降低(P<0.01).P3-MSCs的EPOR表达阳性;用10 IU/ml EPO刺激4 d后,EPOR、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2(pJAK2)及磷酸化信号转导和转录因子-5(pSTAT-5)的表达均明显上调.结论 EPO能促进体外培养的骨髓MSCs增殖,该效应经EPOR介导,并与JAK2-STAT-5信号途径有关.     

膀胱癌中EPO及其受体的实验研究

目的:通过检测膀胱移行细胞癌(TCC)中的促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)表达,并结合临床病理分级探讨其意义。方法:70例膀胱TCC组织、15例癌旁组织、10例正常膀胱组织分别以免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测EPO和EPOR的蛋白和mRNA的表达。结果:膀胱TCC组织中EPO蛋白阳性表达率62.9%(44/70),EPOR蛋白阳性表达率41.4%(29/70);15例膀胱TCC癌旁组织及10例正常膀胱组织均未见EPO、EPOR蛋白的表达。EPO蛋白表达强度与膀胱TCC的组织学分级相关(rs=0.329,P<0.05),而与临床分期无明显的相关性。RT-PCR检测发现膀胱移行细胞癌组织中EPO及EPORmRNA的表达明显高于正常膀胱组织、癌旁组织中EPO及EPORmRNA的表达(P<0.01)。结论:EPO、EPOR在膀胱TCC组织中过表达,提示EPO、EPOR在膀胱TCC的发生、发展过程中可能起重要作用;EPO蛋白表达强度与膀胱TCC的组织学分级有明显相关性,可能成为膀胱TCC不良预后的指标之一。     

大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型的建立

[目的]建立大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型.[方法]为了模拟椎间盘内部低营养低代谢环境,采用低胎牛血清培养法培养椎间盘软骨终板细胞分别含0％,1％,3％,5％,8％,10％胎牛血清,设置不同浓度梯度筛选最佳浓度,检测凋亡率、凋亡蛋白表达及caspase酶活性.[结果]低胎牛血清培养组细胞发生形态改变,DAPI染色阳性细胞增多;流式细胞仪检测凋亡率随着FBS浓度降低而升高,1％为最有效诱导凋亡浓度;Western blot示FAS、caspase-3、PARP、细胞色素C表达在1％ FBS组明显高于10％时,同时caspase-3/8/9酶活性增高.[结论]低胎牛血清培养法能诱导体外培养的软骨终板细胞发生凋亡,最终会引起细胞功能丧失和椎间盘退变,caspase家族可能参与了这一过程.     

脐血单核细胞的优化培养

目的 优化脐血单核细胞( UCB-MNCs)的培养方法.方法 采用正交实验方法筛选影响UCB-MNCs培养的各因素,优化培养条件.设立优化组、对照组(UCB-MNCs以1.0×106/L接种于含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、体积分数为0.10胎牛血清、低糖DMEM培养基)培养.其后检测各组培养细胞增殖及形态学变化;流式细胞仪对各组行免疫表型分析.结果 筛选后优化培养条件为:低糖DMEM培养基中含20 mg/L bFGF、50 μg/L干细胞因子(SCF)、10 μg/L重组人粒细胞生长因子(G-CSF)、培养瓶用层粘连蛋白(LN)包被.原代培养的细胞密度优化组细胞( 108.15±6.90)增殖优于对照组(51.48±12.27),差异有统计学意义(P＜0.01).P3代UCB-MNCs中MSCs含量优化组(94.87％)优于对照组(75.35％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用正交实验的方法可以筛选出脐血单核细胞的优化培养条件.     

ARA290抑制糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)衍生肽ARA290对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用及其可能机制。方法采用链脲菌素腹腔注射制备糖尿病大鼠模型。将成模大鼠随机分为4组:糖尿病模型组(DM组)皮下注射生理盐水0.5 mL,隔日1次;ARA290治疗组(DA组)皮下注射ARA290(50 U/kg),隔日1次;EPOR阻断肽+ARA290治疗组(DAEB组)皮下注射EPOR阻断肽(10μg/kg)和ARA290(50 U/kg),隔日1次;CD131阻断肽+ARA290治疗组(DACB组)皮下注射CD131阻断肽(10μg/kg)和ARA290(50 U/kg),隔日1次。同时设立正常对照组(NC组),皮下注射生理盐水0.5 mL,隔日1次。药物干预12周后检测大鼠尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)、尿N-乙酰葡萄糖苷酶(N-acetylglucosidase,NAG)、β_2微球蛋白(β_2-microglobulin,β_2-MG)、α_1微球蛋白(α_1-microglobulin,α_1-MG)、血肌酐(Scr)。肾组织切片HE染色,观察肾脏病理变化。采用免疫荧光检测肾脏EPO受体(EPO receptor,EPOR)、CD131的表达,TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡,免疫组化及Western印迹检测大鼠肾脏Caspase-3表达。结果免疫荧光检测显示大鼠肾脏表达EPOR、CD131,且两者存在共定位表达;TUNEL检测显示ARA290可以抑制糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡;免疫组化及Western印迹检测显示ARA290降低糖尿病大鼠肾脏Caspase-3表达;生化检测显示ARA290可以降低糖尿病大鼠UAER、尿NAG、β_2-MG、α_1-MG、Scr,HE染色显示ARA290可以减轻肾脏病理损伤。此外,给予糖尿病大鼠ARA290和EPOR或CD131阻断肽皮下注射后,ARA290抑制糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡、降低早期肾脏病变指标及减轻肾脏病理损伤的作用减弱。结论大鼠肾脏表达EPOR和CD131,EPO衍生肽ARA290可通过EPOR、CD131介导抑制糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡,发挥肾脏保护作用。     

红细胞生成素对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制

目的 观察红细胞生成素（EPO）对糖尿病大鼠的肾脏保护作用,并探讨其发挥肾脏保护作用的可能机制。 方法 将实验大鼠随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病模型组（DM组）和EPO治疗组（DE组）。药物干预8周后,处死大鼠,检测尿白蛋白排泄率（UAER）、血清肌酐（Scr）、血细胞比容（Hct）。肾组织切片行HE、PAS染色,观察大鼠肾脏病理改变。化学比色法检测肾脏丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及总抗氧化能力（T-AOC）。免疫荧光及Western印迹法检测大鼠肾脏EPO受体（EPOR）的表达。免疫组织化学及Western印迹法检测大鼠肾脏NADPH氧化酶亚基（p47phox）、转化生长因子β1（TGF-β1）、纤连蛋白（FN）的表达。 结果 EPO可以减轻糖尿病大鼠肾脏病理及功能改变。各组大鼠肾脏均表达EPOR,但表达水平比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。与NC组相比,DM组大鼠p47phox、TGF-β1、FN蛋白表达增强（均P ＜ 0.01）;GSH-Px、SOD活性及T-AOC下降（均P ＜ 0.01）;MDA含量增加（P ＜ 0.01）。与DM组相比,DE组大鼠p47phox、TGF-β1、FN蛋白表达减弱（均P ＜ 0.05）;GSH-Px、SOD活性及T-AOC升高（均P ＜ 0.01）;MDA含量降低（P ＜ 0.01）。 结论 EPO可通过抑制糖尿病大鼠肾脏氧化应激,降低TGF-β1、FN表达,减轻糖尿病大鼠肾脏病理改变,发挥肾脏保护作用。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的 观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。 方法 抽取SD大鼠的骨髓,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基;（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA;（3）联合诱导组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA+表皮生长因子（EGF）+骨形成蛋白（BMP-7）。诱导7 d后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达;免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果 流式细胞仪显示,体外分离培养的第3代MSC,CD44阳性细胞表达率为97.8%±0.9%;CD90阳性细胞表达率为96.8%±1.4%;CD29阳性细胞表达率为97.6%±2.4%;而CD11b/c阳性细胞表达率为13.2%±0.6%; CD34阳性细胞表达率为1.2%±0.5%。诱导7 d后,与对照组长梭形细胞相比,ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列;联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形,细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示,对照组细胞为阴性;ATRA组部分细胞阳性;联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示,ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29.47%±1.08%和47.52%±2.13%,显著高于对照组（P ＜ 0.05）;E-cadherin阳性表达率分别为14.88%±2.46%和36.15%±1.13%,也显著高于对照组（P ＜ 0.05）。 结论 在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。     

CD131在促红细胞生成素抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的 检测大鼠肾小管上皮细胞是否表达CD131并探讨其在促红细胞生成素(EPO)抑制大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用.方法 传代培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,将NRK-52E细胞随机分为正常对照组、高糖组、高糖+EPO组、高糖+EPO+Scramble siR-NA 组、高糖+EPO+EPO受体(EPOR)siR...     

猪急性创面不同部位组织匀浆液对体外培养的成纤维细胞凋亡的影响及其机制

目的　探讨猪急性创面不同部位组织匀浆液对体外培养的成纤维细胞 (fibroblast,FB)凋亡的影响。　方法　在 6只小型猪的背部造成直径 4 cm的圆形全层皮肤缺损创面 ,用取下的真皮组织进行 FB原代培养。在创面形成后第 15天 ,取创面中心及边缘新生上皮下的组织匀浆 ,离心后将上清液 - 70℃冰箱保存备用。用第 4代 FB进行实验 ,根据培养液的不同分成 7组 : 组 :DMEM+5 %胎牛血清 ; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 ; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 +10μg/ ml广谱基质金属蛋白酶抑制剂 (GM6 0 0 1) ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 +10μg/ ml GM6 0 0 1; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 +10 ng/ ml酸性成纤维细胞生长因子 (acid fibroblast growth factor,a FGF) ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 +10 ng/ ml a FGF。在上述培养液中培养 16 h,均采用同一动物的匀浆液处理该动物来源的 FB(n=6 )。采用 PI和标记 FITC的 Annexin 作为探针 ,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。　结果　各组细胞凋亡率分别为 : 组 4 .39%± 0 .4 1% , 组 10 .98%±1.4 2 % , 组 13.4 7%± 1.4 4 % , 组 7.2 %± 0 .4 6 % , 组 12 .1%± 0 .85 % , 组 3.9%± 0 .6 3% , 组 9.8%± 0 .5 0 % ;     

红细胞生成素对体外培养许旺细胞的作用

目的 观察促红细胞生成(erythropoietin,EPO)对体外培养许旺细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和细胞周期的影响,探讨EPO促进外周神经再生的可能机制. 方法 将原代培养、纯化的许旺细胞随机分成三组:A组(10%胎牛血清DMEM液)、B组(10%胎牛血清DMEM液加10U/ml EPO),C组(10%胎牛血清DMEM液加50 U/ml EPO),应用ELISA测定培养上清液中的GDNF水平,流式细胞术检测细胞周期分布. 结果 与A组相比,B组和C组培养上清液中的GDNF明显增高,许旺细胞处于S期百分比(S%)和(S+G_2M)%都有明显升高. 结论 EPO可增加体外培养许旺细胞分泌GDNF,并且能提高许旺细胞的增殖活性,这可能是其促进外周神经再生的重要机制之一.     

Effect of erythropoietin on the oriented chemotaxis of bone-marrow mesenchymal stem cells under acute kidney injury microenvironment

Objective To investigate the migration of bone-marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) under acute kidney injury (AKI) microenvironment in vitro and the effect of erythropoietin (EPO) intervention, and to explore its underlying mechanism. Methods Renal tubular epithelial cells (RTECs) were cultured in hypoxia/ re-oxygenation (HR) condition for 12 h, respectively, in order to establish HR-RTEC. BMSCs and RTECs were co-cultured by Transwell system and were divided into 7 groups: control group (group①, only BMSC cultured), BMSC-RTEC co-culturing group (group②), BMSC-HR-RTEC co-culturing ＋EPO intervention groups (group③to group⑦, EPO concentration: 0, 1, 5, 10, 50 IU/ml). All the groups were cultured for 48 h and the number of migrating BMSCs was detected. Western blotting was applied for the detection of SDF-1 expression in RTECs and p-MAPK and MAPK levels in BMSCs. SDF-1 concentration in the RTECs culture supernatant was tested by ELISA. Results The number of BMSCs migrating to the low chamber where HR-RTECs were cultured was increased, and EPO intervention further enhanced this migration which reached the peak at the concentration of 10 IU/ml [Compared with group③, (46.67±7.37) cells vs (19.00±2.37) cells, P＜0.05]. Intracellular expression level and the secreated level of SDF-1 in HR-RTECs in group③ were higher than those in RTECs of group② [0.37±0.01 vs 0.19±0.01, P＜0.05; (61.64±4.88) μg/L vs (35.26±8.78) μg/L, P＜0.05]. EPO intervention increased above SDF-1 levels and reached the peak at the concentration of 10 IU/ml [group⑥ vs group③：(173.53±14.66) μg/L vs (61.64±4.88) μg/L, P＜0.05], accompanied with enhanced phosphorylation of MAPK in BMSCs. Conclusions AKI microenvironment has obvious chemotaxis effect on BMSCs, and EPO intervention can strengthen this effect. The increased SDF-1 level and enhanced phosphorylation of MAPK, the downstream signal protein of SDF-1/CXCR4 axis, are the possible mechanism for EPO performance.     

HO-1基因修饰对急性肾损伤微环境下骨髓间充质干细胞增生分化的影响

目的观察经血红素加氧酶-1(HO-1)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肾损伤(AKI)微环境下的增生分化,并探讨其机制。 方法Gateway技术构建含HO-1目的基因的质粒,同时构建仅含示踪基因eGFP的对照载体;脂质体法转染293FT细胞获得慢病毒原液lenti-HO-1-eGFP和lenti-eGFP;稀释后分别感染BMSCs获得HO-1-BMSCs和eGFP-BMSCs(空载体对照),检测转染细胞的活力、分化潜能。制作缺血再灌注诱导AKI大鼠的肾脏匀浆上清(AKI-KHS),以正常大鼠肾脏匀浆上清(N-KHS)作为对照,分别干预BMSCs、eGFP-BMSCs和HO-1-BMSCs,构成空白组(BMSCs组)、对照组(BMSCs/N-KHS组)、BMSCs/AKI-KHS组、eGFP-BMSCs/AKI-KHS组和HO-1-BMSCs/AKI-KHS组,于37℃、5% CO₂培养箱中培养3 d。MTT法检测培养BMSCs的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞超微结构变化,免疫组化法检测细胞内角蛋白18(CK18)表达,Western印迹对各组细胞内HO-1、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pAKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)水平进行检测。用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。 结果基因修饰并未改变BMSCs活力及多向分化潜能。与对照组比,BMSCs/AKI-KHS组的细胞生长抑制率和凋亡阳性细胞比例显著增加(t＝12.581,t＝16.283;P<0.05);经HO-1基因修饰后,HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的细胞生长抑制率和凋亡阳性细胞比例均有显著下降(t＝5.958,t＝7.957;P<0.05)。AKI-KHS可诱导BMSCs出现肾小管上皮细胞样分化的超微结构改变,胞浆中可观察到CK18表达,以HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的CK18^＋细胞比例最高(t＝4.057,P<0.05)。与BMSCs/AKI-KHS组相比,HO-1-BMSCs/AKI-KHS组的细胞内HO-1蛋白水平显著增高(t＝4.163,P<0.05),并伴随着细胞内pAKT、pERK蛋白水平显著增高(t_pAKT＝14.305,t_pERK＝7.148;P<0.05)。 结论HO-1基因修饰可改善AKI微环境下培养BMSCs的增殖,细胞凋亡减轻,向肾小管上皮样细胞转分化能力增加,HO-1的过表达及其下游的AKT、ERK为发挥作用的可能信号通路。     

重组人红细胞生成素预处理对肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中PI3K-Akt-GSK-3β通路的调控作用

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）通路对人肾小管上皮细胞（HK-2）缺血再灌注（IR）损伤过程中细胞凋亡的调控及重组人红细胞生成素（rHuEPO）的保护作用。 方法 正常培养的HK-2细胞,分为7组：正常对照组、IR组、LY294002干预组（PI3K-Akt阻断剂,10 μmol/L）、LiCl干预组（GSK-3β阻断剂,20 μmol/L）、rHuEPO干预组（20 U/L）、rHuEPO+LY294002干预组、rHuEPO+LiCl干预组。Western印迹法检测Akt（Ser473）、GSK-3β（Ser9）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）活性; MTT法检测细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡。 结果 IR损伤诱导HK-2细胞凋亡率上调（15.20%±1.43％）、Akt活性水平下降、GSK-3β及caspase-3酶活性水平上调,与正常对照组相比,差异有统计学意义（P < 0.05）。与IR组相比,LY294002干预使细胞凋亡率进一步上调（18.20%±2.06％）、Akt活性水平下调、GSK-3β及caspase-3酶活性上调,LiCl干预使细胞凋亡率下调（12.30%±0.85％）、Akt活性水平上调、GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异均有统计学意义（P < 0.05）。rHuEPO干预与IR组相比,细胞凋亡率下降（11.10%±1.62％）、Akt活性水平升高而GSK-3β及caspase-3酶活性下调,差异有统计学意义（P < 0.05）。与rHuEPO干预相比,rHuEPO+LY294002双干预细胞凋亡率升高（13.40%±1.94％）、Akt活性水平下降而GSK-3β及caspase-3酶活性上调,rHuEPO+LiCl双干预细胞凋亡率下调（7.50%±1.31％）、Akt活性水平上升而GSK-3β及caspase-3酶活性下降,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 IR损伤可引起肾小管上皮细胞凋亡,Akt活性降低及GSK-3β活性升高,影响caspase-3依赖的外源性凋亡途径可能是其凋亡机制之一。rHuEPO可通过增强Akt活性,降低GSK-3β及caspase-3酶活性,从而减轻细胞凋亡,对HK-2 IR损伤有一定的保护作用。     

Role of OMA1 in lipopolysaccharide-induced acute kidney injury

Objective To investigate the role of OMA1 in acute kidney injury (AKI) induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods OMA1 wild-type and knocked out mice (8 week old) were injected with 10 mg/kg body weight of LPS. The model was confirmed by testing mouse serum creatinine and blood urea nitrogen. The apoptosis in mouse kidney cortex was examined by TUNEL staining and cleaved caspase 3. In vitro, in humam kidney proximal tubular cells (HK2) were knocked down OMA1 by transfecting OMA1 shRNA, with the scramble shRNA being used as negative control of transfection. HK2 cells were cultured with 5 μg/ml of LPS for 24 hours to induce apoptosis. DAPI staining of cells and caspase-3 activity were applied to test apoptosis. The images of mitochondria in cells were obtained by transfection of mito-green plasmid and OMA1 shRNA. Western blotting was used to exam the OMA1 and Cytochrome C expressions. Results Compared with OMA1 KO mice, LPS induced more severe AKI of WT mice with higher Scr [(97.2±26.5) μmol/L vs (53.0±17.7) μmol/L, P＜0.05] and BUN [(43.3±13.7) mmol/L vs (29.7±7.7) mmol/L, P＜0.05]. Moreover, there were more apoptosis cells in kidney cortex in WT mice than in OMA1 KO mice [(75.4± 26.1)/mm2 vs (38.3± 14.4)/mm2, P＜0.05]. About 46% of OMA1 expressions in HK2 cells were inhibited by OMA1 shRNA transfection (P＜0.05). Further, OMA1 shRNA cells with LPS stimulation had decreased mitochondria fragmentation [(29.8±10.9)% vs (43.2±6.8)% , P＜0.05], Cytochrome C release [(37.0±12.3)% vs (76.0±26.2)%, P＜0.05], and cell apoptosis [(13.2±3.9)% vs (25.0±7.1)%, P＜0.05] as compared with control cells. Conclusion Knockdown of OMA1 alleviated septic AKI through inhibition of cell apoptosis, mitochondria fragmentation, and Cytochrome C release.