ADA—LacZ融合基因直接注射导入大鼠骨骼肌后的表达

ＡＤＡ－ＬａｃＺ融合基因经直接注射导入大鼠骨骼肌内，用Ｘ－ｇａｌ和ＡＤＡ组化染色方法检测的结果表明：在大鼠骨骼肌细胞中，可检测到由ｐＦＰ表达的ＡＤＡ和β－ｇａｌ活性。这提示有望探索出一条对某些遗传性疾病、肿瘤及其它多种疾病导入外源基因实施基因治疗的便捷、可行的途径     

人酪氨酸羟化酶催化核心DNA片段的克隆与表达

获得编码人酪氨酸羟化酶催化核心ｃＤＮＡ片段,并观察其表达。方法采用人的全长ＴＨｃＤＮＡ为模板,设计特定的引物进行ＰＣＲ扩增反就并构建真核表达载体－质粒ｐＣＭＶＴＨｃ。在对目的片段测序后,将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内,用免疫组织化学方法检测其表达。     

帕金森病大鼠未注射侧纹状体和黑质酪氨酸羟化酶的表达

目的:观察不同病程偏侧帕金森病(PD)大鼠未注射侧纹状体和黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达.方法:6-羟基多巴胺(6-OHDA)右侧前脑内侧束立体定位注射1周,阿朴吗啡旋转实验筛选PD模型大鼠,随机分为2、4周和6周模型组,另设正常对照组.行嘴侧纹状体节段和黑质节段连续冠状石蜡切片,采用焦油紫染色定位,以TH抗体免疫组织化学阳性显示多巴胺(DA)能神经元胞体和纤维.结果:正常对照组和2周模型组大鼠左侧纹状体有较强的TH表达,而4周和6周模型组左侧纹状体的TH表达强度较上述两组降低,4周和6周模型组之间无差异.4组大鼠左侧黑质TH表达阳性细胞数无差异.正常对照组、2周和4周模型组左侧黑质有较强的TH表达,3组的表达强度无差异,而6周模型组左侧黑质的TH表达强度较上述3组均降低.结论:6-OHDA单侧注射制备的PD模型大鼠,注射侧的长期病变致未注射侧纹状体和黑质TH的表达减弱.     

含酪氨酸羟化酶的神经元在猴延髓内脏带内的分布及形态特点

为观察含酪氨酸羟化酶（ＴＨ）阳性神经元在猴延髓内脏带内的分布及形态特点，使用免疫组织化学方法对３只恒河猴的延髓中尾段进行了研究。结果证明，延髓中尾段的ＴＨ阳性神经元集中分布于从背内侧至腹外侧的弧形带状区－－人脏带内（ＭＶＺ）。该区可分为背内侧部、腹外侧部和中间部。在背内侧部，ＴＨ阳性结构主要分布于迷走神经前运动核、最后区、孤束核的连合亚核、胶状质亚核和内侧亚核。在腹外侧部，由发愤侧向吻侧范围逐渐扩     

精神分裂症致炎性细胞因子、酪氨酸羟化酶基因表达水平与临床症状的关系

目的检测精神分裂症患者致炎性细胞因子(白介素-1β、肿瘤坏死因子-α)和酪氨酸羟化酶(TH)的基因表达水平,探讨其与临床症状的关系。方法采用送转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和半定量技术,分别检测39例精神分裂症患者,25例同胞对照和30例正常对照外周血单个核细胞IL-1β、TNF-α和TH的基因表达水平,同时应用PANSS量表评定精神分裂症患者临床症状。结果IL-1β在病例组、同胞对照组和正常对照组的基因表达水平分别为1.52±1.01、1.18±0.99和0.55±0.33;TNF-α在三组样本的基因表达水平分别为1.52±1.09、1.01±0.87和0.61±0.32;TH在三组样本的基因表达水平分别为0.74±0.38、0.70±0.29和0.28±0.20。其中病例组与同胞对照组IL-1β、TNF-α、TH基因表达水平无显著差异(P>0.05);病例组和同胞对照组的IL-1β、TNF-α、TH基因表达水平均显著高于正常对照组(P<0.05或P<0.01)。同时发现IL-1β(r=0.420)、TNF-α(r=0.430)基因表达水平与PANSS量表的一般病理症状分显著相关(P<0.01)。结论精神分裂症患者存在多巴胺功能亢进和致炎性细胞因子的过度表达,且可能受遗传背景影响。致炎性细胞因子可能参与精神分裂症一般病理症状的形成。     

偏执型精神分裂症外周血IL-1β、TNF-α和酪氨酸羟化酶的mRNA表达水平

目的检测偏执型精神分裂症患者白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和酪氨酸羟化酶(TH)的基因表达水平,探讨偏执型精神分裂症的外周神经免疫机制.方法采用RT-PCR和半定量技术,分别检测39例偏执型精神分裂症患者和30例正常对照外周血单个核细胞IL-1β、TNF-α和TH的基因表达水平.结果显示病例组的IL-1β、TNF-α、TH基因表达水平均显著高于正常对照组(P＜0.01).且对照组IL-1β和TNF-α基因表达水平显著相关(r=0.847,P＜0.01);IL-1β和TH基因表达水平相关性较为显著(r=0.666,P＜0.01).病例组只有IL-1β和TNF-α基因表达水平表现为显著的相关(r=0.942,P＜0.01).结论偏执型精神分裂症患者可能存在致炎性细胞因子和儿茶酚胺类神经递质的过度表达;儿茶酚胺类神经递质和致炎性细胞因子的基因表达之间可能具有一种交互机制,而偏执型精神分裂症患者的这种交互机制发生了紊乱.     

HLA A表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

目的 观察人白细胞抗原A（HLA A）敲减和酪氨酸羟化酶(TH)过表达的人胚肺成纤维细胞(HELFs) 于脑内移植后帕金森病(PD)大鼠的旋转行为和脑内炎性反应。方法 用TH反转录病毒和携带HLA A干扰序列的慢病毒（表达绿色荧光蛋白GFP）感染细胞后移植于PD大鼠模型纹状体。移植后检测大鼠旋转行为,免疫组化染色观察TH、OX42、OX6和GFAP表达,GFP观察移植物存活。同时移植HELFs以及TH转导的HELFs和大鼠肺成纤维细胞作对照。结果 移植后GFP荧光细胞数量逐渐减少,HLA A敲减组细胞的减少相对较轻,但对大鼠旋转行为的改善不明显;OX42阳性小胶质细胞改变不明显,但OX6表达逐渐增加,而GFAP阳性细胞激活逐渐下降但仍强于移植对侧。结论 HLA A表达沉默细胞移植对大鼠运动症状改善不明显,细胞移植能激活小胶质细胞和星形胶质细胞。     

携带酪氨酸羟化酶基因的质粒和逆转录病毒在大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞中表达效率的比较

目的　为提高体外转基因 (exvivo)治疗帕金森病大鼠模型的疗效 ,本实验拟比较两种基因表达载体介导的外源基因在两种不同运载细胞的瞬时表达效率。　方法　分别将酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组表达质粒和重组逆转录病毒导入原代培养的大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞 ,用免疫组织化学检测TH的表达效率 ;Westernblot法检测样品中TH特异性条带并转换成A值 ,以比较其在不同细胞中表达的相对含量。　结果　免疫组织化学检测表明 ,表达质粒的转染率为 5 %～ 7% ,逆转率病毒的感染率为 18%～ 2 0 % ;根据GDNF标准品蛋白条带含量与Westernblot结果的相应A值的标准曲线 ,推断出质粒转染和逆转率病毒感染的成纤维细胞中单个阳性细胞表达的TH相对平均含量分别为 4 76× 10 - 2 A和 4 35× 10 - 2 A ,质粒转染和逆转率病毒感染的脑胶质细胞分别是 5 4 5×10 - 2 A和 5 0 5× 10 - 2 A。　结论　不论是质粒载体还是逆转录病毒载体所携带的外源基因在两种细胞的单个阳性细胞中的表达无显著性差异。但由于逆转录病毒载体的感染率高于质粒载体 ,对于原代培养的成纤维细胞和脑胶质细胞 ,逆转率病毒载体是一种更好的表达载体。     

骨骼肌细胞αB-晶状体蛋白基因在大强度离心运动后的表达

背景：骨骼肌含有被称为“分子伴侣”的小热休克蛋白αB-晶状体蛋白,有可能在肌肉运动中具有重要的生理功能。 目的：观察离心运动后骨骼肌细胞αB-晶状体蛋白基因表达。 方法：将成年雄性Wistar大鼠随机分为安静对照组和运动后即刻组,运动后24 h组。安静对照组正常喂养,两个运动组进行一次性大负荷离心运动,分别取对照组腓肠肌和运动组运动后0和24 h的腓肠肌,使用冰冻切片原位杂交法检测αB-晶状体蛋白基因表达情况。 结果与结论：骨骼肌细胞αB-晶状体蛋白基因在对照组呈低水平表达,在运动后即刻和运动后24 h组均呈较高表达 (P < 0.05),αB-晶状体蛋白基因表达杂交信号主要位于肌细胞膜下。结果证实,大强度离心运动可诱导骨骼肌细胞αB-晶状体蛋白基因表达增高。     

AAV-GDNF/TH双基因载体的构建及表达

目的 探讨构建于同一个重组腺相关病毒(rAAV)载体上的酪氨酸羟化酶(TH)基因和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因是否能够同时表达.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测双基因在HEK293包装细胞中的转录;通过免疫细胞化学荧光染色和免疫组织化学染色技术分别检测双基因在体外培养大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和大鼠脑中的表达.结果 在HEK293包装细胞和BMSCs中分别同时检测到了GDNF和TH基因RNA和蛋白的表达.对照LacZ在HEK293包装细胞和骨髓基质细胞中的表达率分别为50%和15%.大鼠脑组织切片中注射AAV-GDNF/TH病毒的部位与注射PBS的对侧相比无论是GDNF还是TH的表达均显著增加(P＜0.01).结论 构建于同一个rAAV载体上的TH基因和GDNF基因体内体外都能够同时表达,此结果为PD的基因治疗提供了新的依据.     

人TH基因重组腺病毒的构建及生物学活性研究

将人酪氨酸羟化酶cDNA表达盒克隆于质粒型腺病毒载体p△Elsp1A，得到重组质粒pAd－TH。随后用脂质体法将重组质粒pAd－TH和拯救型腺病毒质粒pBHG11一起共转染293细胞，通过体内同源重组生成重组腺病毒AdCMVth，THcDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。采用形态学、病毒核酸酶切和PCR／RT－PCR等方法进行鉴定正确。重组腺病毒滴度达到1010pfu／ml。初步结果表明，该重组腺病毒感染MN9D细胞后可使细胞内多巴胺水平增加1倍，显示出明显的TH生物学活性。提示TH重组腺病毒AdCMVth可作为高效的基因转移载体用于帕金森氏病基因治疗。     

人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究

目的 制备地高辛标记的人酪氨酸羟化酶（ｈＴＨ２）ｃＲＮＡ探针。方法 用分子克隆技术重组质粒ｐＧＥＭＴＨ２。用体外转录法制备地高辛标记ｈＴＨ２ｃＲＮＡ探地，经限制性内切酶分析，显示重组质粒含有酪氨酸羟化，酶基因片段，且插入位点正确。使用斑点杂交证实我们制备的探针是敏感可靠的。结果 杂交阳性部位呈紫蓝色，深浅与稀释度成正比。     

携带酪氨酸羟化酶基因的逆转录病毒载体pELSNTH的构建

为高效表达酪所酸羟化酶基因，用分子克隆技术，构建以莫洛尼鼠白血病毒改造的逆转录病毒ｐＥＬＳＮ为载体含ＴＨ基因的表达载体ｐＥＬＳＮＴＨ，为帕金森病动物模型的实验性基因的治疗提供有效手段。     

Forskolin上调MN9D细胞Nurr1的表达及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体（Nurr1）表达的信号分子,研究Nurr1表达增高对酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响,探讨激活Nurr1表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化学及Westernblot方法检测MN9D细胞内源性Nurr1表达的变化,以及Nurr1表达增加对TH表达的影响。利用PKA信号转导通路的特异性抑制剂H89探讨激活Nurr1表达的信号机制。结果1．从加入Forskolin1h起,直至6h,MN9D细胞Nurr1表达比未加Forskolin组明显增加（P〈0．05）;Forskolin主要增加MN9D细胞核内Nurr1含量,而细胞浆内Nurr1含量变化不明显;Forskolin作用后MN9D细胞TH表达无明显变化。2．用蛋白激酶A的特异性抑制剂H89预处理后,Forskolin仍具有增加Nurrl表达的作用。结论Forskolin可增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位,单纯Nurr1表达及核转位增加不影响MN9D细胞TH的表达,TH表达的激活可能还需要其他特殊的细胞（或神经元）环境或共激活因子的共同作用。Forskolin增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位的作用不是主要通过激活PKA信号转导通路完成的。     

同型半胱氨酸诱导基因在正常和畸形人胚心脏中的表达

目的 研究同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在发育不同时期的正常人胚和畸形人胚心脏中的表达,揭示HCY-2表达蛋白在人胚心肌细胞发育和分化中的作用。方法 取正常和先天性畸形人胚心脏,采用免疫组织化学及图像分析技术对心脏内HCY-2表达变化进行定量测定分析。结果 HCY-2在人胚心脏发育整个时期均表达,其表达部位主要在心肌纤维内;先天性畸形人胚心脏中的HCY-2表达增强。结论 HCY-2表达蛋白通过影响心肌细胞的增殖而影响人胚心脏发育过程,其表达异常与先天性畸形的发生密切相关。     

逆转录病毒载体ex vivo途径表达TH和GDNF基因

为了通过逆转录病毒载体 ex vivo途径高效表达 TH和 GDNF基因。本实验构建有 TH和 GDNF基因的重组逆转录病毒载体 p LHCX/TH和 p L NCX2 /GDNF,分别转染包装细胞 PA3 17和 PT67中 ;经筛选、RT-PCR、免疫组化等鉴定得到产毒细胞 PA3 17/TH和 PT67/GDNF。培养 COS-7细胞 ,以两种产毒细胞的上清分别感染 COS-7细胞 ,筛选后 ,免疫组化、原位杂交检测基因的表达量 ,将基因改造的细胞移植到大鼠纹状体内 ,免疫组化检测体内移植的 TH、GDNF基因的表达。结果表明 :TH和GDNF基因可在靶细胞表达 ,且筛选后基因表达阳性细胞显著增加 ;TH阳性率达 5 0 % ,GDNF阳性率达 70 %。在体内实验中 ,可以观察到这两种外源基因可同时在大鼠脑内移植区表达。以上结果提示 ,TH和 GDNF基因改造细胞 ,可通过 ex vivo途径在脑内移植区高效表达。这一实验结果将对 Parkinson病复合性基因治疗提供依据     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

外源基因在人造血干祖细胞中的转移和表达

应用逆转录病毒载体介导基因转移法将ｎｅｏ~ｒ基因导入人造血干祖细胞，并经体外液体长期培养。结果表明，产重祖病毒细胞ＰＡ３１７／Ｎ２的病毒滴度最高达６．５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ，用ＰＣＲ法从体外培养２、４、６ｗ及加入ｒＩＬ－１、ｒＩＬ－６的悬浮和贴壁的转染细胞中均可扩增出ｎｅｏ~ｒ基因ｃＤ－ＮＡ片段，非同位素化学发光法标记ｎｅｏ~ｒ探针与之杂交显示阳性结果。表明逆转录病毒介导目的基因已有效地转入体外培养的人造血干祖细胞中，并进行表达。