一种新贴壁细胞冻存液的研发与评价

目的 评价一种新的贴壁细胞冻存液。方法 使用含7.5%二甲基亚砜(DMSO)(V/V%)、17.5%丙二醇(V/V%)、2.5%聚乙二醇(V/V%)、10%胎牛血清(FBS)(V/V%)的达氏修正依氏培养液(DMEM)作为新型冻存液,对MDCK、LLC-MK2、HEp-2等3种贴壁细胞进行冻存实验。实验分常规冻存组、贴壁细胞冻存对照组和贴壁细胞冻存组,通过观察细胞形态并以HEp-2细胞为典型绘制细胞生长曲线;利用细胞病变法及免疫荧光法检测复苏的贴壁细胞对甲型流感病毒、副流感3型病毒、呼吸道合胞病毒的敏感性变化。结果 3种贴壁细胞冻存组复温后细胞保持完整的单层贴壁状态,与常规冻存组细胞复苏培养3 d后的新鲜贴壁细胞形态一致;3种贴壁冻存对照组细胞复苏后其细胞大量死亡,数量急剧减少,细胞间隙增大,细胞呈破碎样。生长曲线结果显示HEp-2贴壁细胞冻存组一直保持5×10⁵/mL水平。对上述病毒的敏感性检测中,贴壁细胞冻存组呈现出典型的细胞病变;感染甲型流感病毒的MDCK贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型或细胞核均质型;感染呼吸道合胞病毒的HEp-2贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型,...     

深低温冻存时限对成骨细胞生物学特性影响的实验研究

探讨深低温冻存不同时限后复苏对成骨细胞生物学特性的影响。取新生SD大鼠颅骨,胶原酶消化法培养成骨细胞。采用活细胞数、成骨细胞增殖功能、碱性磷酸酶(ALP)活性的测定等对深低温冻存1、3、6个月后复苏的成骨细胞和新鲜培养的细胞进行了比较。发现各组成骨细胞在细胞增殖功能、碱性磷酸酶活性方面均无显著性差异(P>0.05)。深低温冻存6个月后复苏组成骨细胞活细胞数与冻存1、3月后复苏组及新鲜培养的细胞组相比,活细胞数降低,有显著性差异(P<0.05),深低温冻存1、3个月后复苏组的活细胞数与新鲜培养的细胞组相比无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明:较长时间深低温冻存能减少复苏后成骨细胞的活细胞数。但经深低温冻存后复苏的细胞仍保持成骨细胞原有的生物学特性。     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较*

背景：传统的细胞冻存多采用4,-20 ℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。 目的：比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。 方法：将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液(10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基)调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预：实验组以纱布包裹,并直接投入-80 ℃冰箱;对照组按常规冻存法,4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱分别预冷30 min和1 h后放入-80 ℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。 结果与结论：复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

人血清和初生牛血清对冻存人淋巴细胞免疫功能影响的比较研究

本实验比较了人AB血清和初生牛血清对冻存的人外周血淋巴细胞的回收及其功能活性的影响。实验发现,两种血清均可使收获率和存活率明显提高。两者进一步比较发现,冻存于含人血清介质的淋巴细胞其转化能力明显高于初生牛血清组;而初生牛血清组其冻存细胞的花环形成和细胞膜受体的稳定性则较前者为好.     

果糖和二硫苏糖醇对骨髓间充质干细胞冻存后活性及多能性的影响

背景:冻存是保证干细胞临床应用的关键步骤之一,但现有冻存技术常导致细胞活性降低、多能性丧失及分化能力下降。目的:探究果糖及二硫苏糖醇是否有助于维持冻存后骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化潜能。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,在细胞冻存前分别用果糖(200μmol/L),二硫苏糖醇(500μmol/L)μmol/L)及果糖(200μmol/L)+二硫苏糖醇(500预处理1 h。冻存6个月后,复苏细胞并用倒置显微镜观察细胞形态,MTT实验检测细胞活性,定量PCR检测相关干性基因(Nanog,Oct4及Sox2)的表达,碱性磷酸酶活性测试及茜素红染色检测复苏骨髓间充质干细胞成骨分化能力。结果与结论:(1)复苏后各组细胞在形态上无明显差别;(2)果糖预处理及联合预处理有助于骨髓间充质干细胞活性维持;(3)二硫苏糖醇预处理可显著促进骨髓间充质干细胞多能性相关基因Nanog及Sox2的表达;(4)果糖、二硫苏糖醇及联合预处理皆有助于维持骨髓间充质干细胞成骨分化潜能,但以二硫苏糖醇及联合预处理组效果最佳;(5)结果表明,果糖预处理有助于维持冻存骨髓间充质干细胞活性,二硫苏糖醇有助于维持冻存骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化能力。     

降钙素基因相关肽对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑cAMP反应元件结合蛋白mRNA表达的影响

目的 探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质cAMP反应元件结合蛋白(CREB)mRNA表达的影响.方法 用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,应用原位杂交和图像分析技术检测大鼠缺血侧海马CA1区和顶叶皮质CREB mRNA表达.结果 假手术组右侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA有明显表达,缺血再灌注组右侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA阳性产物吸光度值减少,CGRP组缺血侧海马CAl区和顶叶皮质CREB mRNA表达的吸光度值比缺血再灌注组增高(P＜0.05).结论 CGRP上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质CREB mRNA的表达,CGRP对缺血神经元的保护作用可能通过激活CREB的转录与翻译,从而启动一系列信号通路来实现.     

NGF对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质CREB表达的上调作用

为探讨外源性神经生长因子(NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和磷酸化CREB(p-CREB)表达的影响,用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学、WesternBlotting和图像分析方法检测大鼠缺血侧顶叶皮质CREB和p-CREB的表达。结果显示:缺血再灌注组CREB表达较假手术组减少,p-CREB表达高于假手术组(P<0.05);NGF组CREB和p-CREB表达高于缺血再灌注组(P<0.05)。以上结果表明NGF明显上调局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质CREB和p-CREB的表达,NGF对缺血神经元的保护作用可能通过上调CREB和p-CREB的表达来实现。     

NGF对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质内CREB mRNA表达的影响

探讨外源性神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质内的cAMP反应元件结合蛋白(cyclicAMPresponseelementbindingprotein,CREB)mRNA表达的影响。用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,运用原位杂交和图像分析技术检测大鼠缺血侧海马CA1区和顶叶皮质内CREBmRNA的表达。结果显示:缺血再灌注组缺血侧海马CA1区和顶叶皮质CREBmRNA阳性反应产物平均光密度(OD)比假手术组减少(P<0.05),NGF组CA1区和顶叶皮质内的CREBmRNA阳性产物平均光密度高于缺血再灌注组(P<0.05)。本研究结果提示NGF可以上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马和顶叶皮质缺血神经元CREBmRNA的表达,NGF对缺血神经元的保护作用可能通过激活CREB的转录与翻译,从而启动一系列信号通路来实现。     

CGRP及NGF对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马cAMP反应元件结合蛋白磷酸化的影响

目的探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)及神经生长因子(NGF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和磷酸化CREB(p-CREB)表达的影响。方法用线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学SABC法、Western blotting和图像分析方法检测大鼠手术侧海马CA1区CREB和p-CREB表达。结果缺血再灌注组海马CA1区CREB表达较假手术组减少,p-CREB表达高于假手术组(P<0.05);CGRP组和NGF组CA1区的CREB和p-CREB表达均高于缺血再灌注组(P<0.05);CGRP与NGF联合应用时CREB和p-CREB表达分别高于CGRP组和NGF组(P<0.05)。结论CGRP及NGF上调局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CREB和p-CREB的表达,CGRP与NGF联合应用则作用更强,CGRP及NGF对缺血神经元的保护作用可能是通过上调神经元内CREB和p-CREB来实现的,CGRP与NGF对缺血神经元的保护有协同作用。