Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的:研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法:利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验,观察组织病理变化;分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞,观察其胶原收缩能力的变化。结果:Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快;成纤维细胞胶原收缩试验中,Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞,而在无血清培养条件下,有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论:SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力,以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。     

应用成纤维细胞胶原网格体外三维培养模型观察重组核心蛋白多糖固相态时对转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的应答

目的:模拟体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1接触方式,研究核心蛋白多糖在固相抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用。方法:实验于2005-01/09在广州市创伤研究所完成。①实验成纤维细胞的组织来源:取材于广州市红十字会医院,患者自愿,正常皮肤为包皮。取新鲜包皮,修除表皮和皮下组织,加入含体积分数0.02的胎牛血清的DMEM培养,实验用第4～8代细胞。②采用醋酸法从鼠尾腱中提取I型胶原,使用浓度为2g/L,网格胶原终浓度为1g/L,成纤维细胞密度为1×109L-1。将胶原细胞混悬液按2mL/皿均匀加入直径35mm的培养皿内,37℃培养10min,混悬液便形成凝胶即成纤维细胞胶原网格,再加入相应的培养液。分为4组:对照组、核心蛋白多糖组、转化生长因子β1组、转化生长因子β1 核心蛋白多糖组。③观察成纤维细胞胶原网格的收缩,Westernblot法检测成纤维细胞胶原网格中成纤维细胞纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达。结果:①成纤维细胞胶原网格收缩的变化:对照组成纤维细胞胶原网格培养12h,收缩到起始面积的(81.2±4.9)%,12～24h收缩加剧,在24h收缩到起始面积的(47.4±4.7)%,以后收缩减慢,在48h收缩到起始面积的(37.3±3.6)%,72h收缩到起始面积的(29.6±3.6)%,96h收缩到起始面积的(28.7±2.8)%,以后不再收缩;核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在12,24,48,72,96h均高于对照组(P<0.05);转化生长因子β1组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均低于对照组(P<0.01);转化生长因子β1 核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均高于转化生长因子β1组(P<0.05),与对照组比较无显著差异(P>0.05)。②成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1391.61±126.27,525.97±60.10),与对照组(1474.52±133.84,569.41±62.55)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(2909.77±264.04,2725.46±150.54)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1775.25±161.09,926.34±51.16)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。③成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.19±0.05,0.07±0.02),与对照组(0.21±0.06,0.08±0.03)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.86±0.15,0.36±0.10)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.34±0.09,0.13±0.04)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:重组核心蛋白多糖融入胶原凝胶,能显著抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用,表明在体内核心蛋白多糖具有拮抗转化生长因子β1的作用。     

应用成纤维细胞胶原网格体外三维培养模型观察重组核心蛋白多糖固相态时对转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的应答

目的：模拟体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1接触方式，研究核心蛋白多糖在固相抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用。 方法：实验于2005-01／09在广州市创伤研究所完成。①实验成纤维细胞的组织来源：取材于广州市红十字会医院，患者自愿，正常皮肤为包皮。取新鲜包皮，修除表皮和皮下组织，加入含体积分数0．02的胎牛血清的DMEM培养，实验用第4-8代细胞。②采用醋酸法从鼠尾腱中提取Ⅰ型胶原，使用浓度为2g/L，网格胶原终浓度为1g／L，成纤维细胞密度为1&;#215;10^9L^-1将胶原细胞混悬液按2mL／皿均匀加入直径35min的培养皿内，37℃培养10min，混悬液便形成凝胶即成纤维细胞胶原网格，再加入相应的培养液。分为4组：对照组、核心蛋白多糖组、转化生长因子β1组、转化生长因子β1＋心蛋白多糖组。③观察成纤维细胞胶原网格的收缩，Western blot法检测成纤维细胞胶原网格中成纤维细胞纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的表达，反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达。 结果：①成纤维细胞胶原网格收缩的变化：对照组成纤维细胞胶原网格培养12h，收缩到起始面积的（81．2&;#177;4．9）％，12-24h收缩加剧，在24h收缩到起始面积的（47．4&;#177;4．7）%，以后收缩减慢，在48h收缩到起始面积的（37．3&;#177;3．6）％，72h收缩到起始面积的（29．6&;#177;3．6）％，96h收缩到起始面积的（28．7&;#177;2．8）％，以后不再收缩；核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在12，24，48，72，96h均高于对照组（P〈0．05）：转化生长因子β1组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均低于对照组（P〈0．01）；转化生长因子β1＋心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均高于转化生长因子β1组（P〈0．05），与对照组比较无显著差异（P〉0．05）。 ②成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的变化：核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达（1391．61&;#177;126．27，525．97&;#177;60．10），与对照组（1474．52&;#177;133．84，569．41&;#177;62．55）比较无显著差异（P〉0．05），转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达（2909．77&;#177;264．04，2725．46&;#177;150．54）显著高于对照组（P〈0．01），转化生长因子β1＋核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达（1775．25&;#177;161．09，926．34&;#177;51．16）显著低于转化生长因子β1组（P〈0．05），且与对照组比较无显著差异（P〉0．05）。③成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA的变化：核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达（0．19&;#177;0．05，0．07&;#177;0．02），与对照组（0．2l&;#177;0．06，0．08&;#177;0．03）比较无显著差异（P〉0．05），转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达（0．86&;#177;0．15。0．36&;#177;0．10）显著高于对照组（P〈0．01），转化生长因子β1＋核心蛋白多糖组纤渣酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达（0．34&;#177;0．09，0．13&;#177;0．04）显著低于转化生长因子β1组（P〈0．05），且与对照组比较无显著差异（P〉0．05）。 结论：重组核心蛋白多糖融入胶原凝胶，能显著抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用，表明在体内核心蛋白多糖具有拮抗转化生长因子β1的作用。     

急性放射性皮肤溃疡伤口收缩迟缓的机制

目的 探讨急性放射性皮肤溃疡伤口收缩迟缓的机制。方法 采用雌性Wistar大鼠，以50Gy^60Goγ射线单次局部照射建立急性放射性皮肤溃疡动物模型，以手术方法建立单纯皮肤伤口模型，观察伤口纤维细胞的改变及α－平滑肌肌动蛋白的表达，并检测伤口组织内羟脯氨酸含量。结果 照射后3－11d胶原纤维出现肿胀、融解、断裂，排列紊乱，照后14－55d溃疡内胶原纤维较单纯伤口内减少，网状纤维渐增多，照射后14－55d放射性皮肤溃疡内α－平滑肌肌动蛋白的表达较单纯田内减弱，羟脯氨酸含量关少。结论 急性放射性溃疡组织内胶原合成减少、纤维组织结构异常以及肌成纤维细胞数量减少与急性放射性皮肤溃疡收缩迟缓的机制有关。     

血管平滑肌细胞表型改变与肿瘤抑制基因p^21 WAF1和p^53的关系

目的：增殖表型血管平滑肌细胞中肿瘤抑制基因p^21 WAF1基因和p^53基因表达可能具有对抗血管平滑肌细胞的增殖能力，观察血管平滑肌细胞表型变化与肿瘤抑制基因p^21 WAF1和p^53的关系。方法：实验于2003-09／10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。应用胶原酶消化法建立大鼠原代培养血管平滑肌细胞，去血清诱导体外培养血管平滑肌细胞分化。流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力，反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin表达变化，反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹杂交方法检测p^21 WAF1和p^53基因表达变化。结果：去血清培养后，原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降，DNA合成前期细胞明显增加[(48．38&;#177;2．35)％]，细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin明显表达。肿瘤抑制基因p^21 WAF1和p^53表达下降。在200g／L血清培养后，大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛，DNA合成前期细胞相对较少[(28．80&;#177;1．58)％]，细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白和calponin表达明显下调，肿瘤抑制基因p^21 WAF1和p^53表达显著增加。结论：肿瘤抑制基因表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关。提示某些病理性增殖过程中肿瘤抑制基因的大量表达可能与其对抗细胞增殖的功能相关，并可能在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用。     

转化生长因子β1对肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质成分的调节与阿魏酸钠的干预效果

背景：细胞外基质在肾间质的积聚是肾小管间质纤维化的主要特征。肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化在肾间质纤维化发病机制中起了重要作用。目的：从细胞水平观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的影响。设计：以细胞为观察对象，随机对照实验：单位：四川大学华西医院肾脏科、材料：大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E来源于American Type Culture Collection（ATCC），由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供，本实验所用细胞株为第36代。阿魏酸钠为白色晶体，可溶于水，纯度〉98．0％，由成都亨达药业有限公司提供，实验时终浓度分别125，250，500μmol／L。兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白多克隆抗体为武汉博士德产品；ELISA试剂盒为上海森雄公司产品；人重组转化生长因子β1为R＆D公司产品：DNA Engine Opdcon^TM实时荧光定量聚合酶链反应仪为MJ Research产品。方法：将体外培养的细胞株NRK52E分为5组；空白对照组：仅加入含血清的DMEM培养基；转化生长因子β1刺激组；培养液中加入终质量浓度为5ng/L的转化生长因子β1；阿魏酸钠低、中、高浓度组：培养液中加入终质量浓度为5ng／L转化生长因子β1和125，250，500μmol／L的阿魏酸钠。主要观察指标：应用相差显微镜、实时荧光定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附法观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的NRK52E细胞转分化的作用及对细胞外基质主要成分胶原Ⅰ胶原Ⅲ和纤维粘连蛋白的影响。结果：①NRK52E细胞形态：与空白对照组相比，转化生长因子β1刺激组细胞在培养3d后，细胞株NRK52E从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞的形态。阿魏酸钠3个浓度组细胞受转化生长因子β1的刺激而出现的形态学改变得到不同程度的改善，并呈剂量依赖性。②α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达：转化生长因子β1 5ng／L诱导6h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA较空白对照组上升，在72h达高峰；经过不同剂量阿魏酸钠干预72h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA显著下调并呈剂量依赖性（P〈0．05）。③细胞外基质变化；经转化生长因子β1 5ng／L诱导72h后，细胞培养上清中Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白含量明显增加（P〈0．05）。经过不同剂量的阿魏酸钠干预后，不同程度地抑制了转化生长因子β1促Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白增多的作用，并呈剂量依赖性（P〈0．05）。结论：转化生长因β1可以诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化，刺激细胞外基质成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的升高。阿魏酸钠可剂量依赖性地抑制转化生长因子β1所导致的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化作用。     

血管平滑肌细胞增殖与转化生长因子β／smads的表达

目的：观察增殖和分化两种血管平滑肌细胞表型改变与转化生长因子β／smads信号传递的关系。方法：实验于2003—09／10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠，常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0．2和0．05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基，37℃，体积分数0．05CO2进行培养，2．5g／L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色，存活细胞数在98％以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态，抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力，蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达变化，反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测转化生长因子βⅠ型受体，smad2，smad3，smad4和smad7的表达变化。结果：①流式细胞分析及蛋白印迹分析方法检测发现，去血清培养后，原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降；DNA合成前期细胞明显增加[(52．42&;#177;2．35)％]，细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白明显表达。体积分数为0．2胎牛血清培养后．大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛，DNA合成前期细胞数相对较少[(17．23&;#177;1．58)％]，细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达明显下调。②反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测发现，去血清培养后的分化表型平滑肌细胞中，转化生长因子β1型受体表达增加，smad2和smad3表达无明显变化，smad4表达增加，smad7表达下降。而高血清培养诱导平滑肌细胞转化为增殖表型后，转化生长因子βⅠ型受体表达下降，smad4表达下降，抑制型smad7表达增加，smad2和smad3表达无明显变化。结论：转化生长因子β／smads表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关。血管平滑肌细胞分化时，可能通过转化生长因子βⅠ型受体／smad4调控细胞分化功能；而血管平滑肌细胞增殖时，细胞则可能通过smad7信号传导通路发挥作用。提示转化生长因子β／smads在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型的改变

背景:近年来的研究表明,血管外膜成纤维细胞在血管损伤后新生内膜的增生中起重要作用,但对于引起血管外膜成纤维细胞表型转化的机制尚不十分清楚.目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变,同时检测对Ⅰ胶原蛋白表达的作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-07/2008-10在上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成.材料;鼠龄2个月的健康雄性SD大鼠,体质量约120 g,用于体外培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;转化生长因子β1由美国GenWay Biotech公司提供;罗格列酮粉剂为北京高盟化工有限公司产品.方法:实验分为3组:转化生长因子β1诱导组:以不同质量浓度的转化生长因子β1(3,5,10,15 μg/L)诱导成纤维细胞48 h;罗格列酮干预组:用不同浓度的PPAR-γ激动剂罗格列酮(5,10,30,50 μmol/L)干预成纤维细胞45 min后,加入转化生长因子β1 10 μg/L共同培养48 h:对照组:不添加任何干预措施.主要观察指标:①免疫组织化学α-平滑肌肌动蛋白检测不同浓度转化生长因子β1、罗格列酮干预后成纤维细胞的表型改变.②蛋白免疫印迹检测成纤维细胞中平滑肌α2肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:不同质量浓度转化生长因子β1诱导成纤维细胞48 h后,与对照组相比,5μg/L转化生长因子β1可明显刺激成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达,10μg/L转化生长因子β1刺激细胞表型改变及平滑肌α 2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达最明显(P<0.05),随后转化生长因子β1再增加至15μg/L,与10μg/L转化生长因子β1浓度组相比,其刺激细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达不再增加(P>0.05).不同浓度罗格列酮干预10 μg/L转化生长因子β1诱导的成纤维细胞48 h后,与对照组相比,30 μmol/L可明显抑制成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达(P<0.05).结论:PPAR-γ激动剂罗格列酮能抑制转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达.     

体外诱导翼状胬肉成纤维细胞向平滑肌细胞的分化

背景：作者前期研究发现翼状胬肉组织中存在平滑肌成分,但此平滑肌的来源并不清楚。目的：探讨翼状胬肉组织中平滑肌成分的起源。方法：组织块法对26例翼状胬肉进行原代细胞培养及鉴定。生长状态较好的原代细胞传代后分为诱导组和对照组,分别置于含或不含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的培养基中培养。倒置显微镜下对比观察两组细胞的形态学变化;共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色波形纤维蛋白和α-平滑肌肌动蛋白在两组细胞中的表达情况。结果与结论：免疫组织化学染色显示所有细胞均表达波形纤维蛋白,鉴定为成纤维细胞。倒置显微镜下观察：对照组细胞呈长梭形,编织状排列;诱导组细胞饱满,胞体增大,呈＂峰-谷样＂生长。共焦显微镜观察：对照组细胞均表达波形纤维蛋白,不表达α-平滑肌肌动蛋白;诱导组细胞除表达波形纤维蛋白外,还不同程度地表达α-平滑肌肌动蛋白,胞浆内可见伸向细胞两极的肌动蛋白丝,证实为平滑肌细胞。结果表明翼状胬肉来源的成纤维细胞在体外经碱性成纤维细胞生长因子诱导可以向平滑肌细胞分化。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养及相关鉴定分析

背景：从以往的文献来看，阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养存在着制作时间长，纯度不高以及易破成纤维细胞污染等诸多缺点。目的：探索兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养技术及纯度鉴定方法。设计、时间及地点：对照实验，于2007-10／2008-03在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市组织工程研究与开发中心完成。材料：成熟的雄性新西兰大白兔5只，体质量2．5～2．8kg。方法：取雄性新西兰兔新鲜的阴茎组织，利用高浓度的胶原酶消化法结合差速贴壁技术对海绵体平滑肌细胞进行纯化培养。以同期兔成纤维细胞作为对照参考。主要观察指标：以四甲基偶氮唑盐分析细胞生长特性；以平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞；以流式细胞仪检测P2及P5代细胞α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率变化情况。结果：培养细胞四甲基偶氮唑盐显示细胞指数增长期为6d左右，随后进入平台期。α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白均呈阳性反应，同期成纤维细胞仅。肌动蛋白显示阳性结果。第2代细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋自、结蛋白阳性率分别65.3％，42．2％，62．3％。经过反复多次的纯化技术至第5代时，上述指标阳性表达率分别上升为92．8％，72．7％，78．1％。结论：通过高浓度的酶消化法及差速贴壁技术可获得高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞，肌球蛋白、结蛋白相对于α-肌动蛋白可以成为鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标。     

急性放射性皮肤溃疡伤口收缩迟缓的机制

目的探讨急性放射性皮肤溃疡伤口收缩迟缓的机制。方法采用雌性Wistar大鼠,以50Gy60Coγ射线单次局部照射建立急性放射性皮肤溃疡动物模型,以手术方法建立单纯皮肤伤口模型,观察伤口纤维组织的改变及α-平滑肌肌动蛋白的表达,并检测伤口组织内羟脯氨酸含量。结果照射后3～11d胶原纤维出现肿胀、融解、断裂,排列紊乱,照后14～55d溃疡内胶原纤维较单纯伤口内减少,网状纤维渐增多。照射后14～55d放射性皮肤溃疡内α-平滑肌肌动蛋白的表达较单纯伤口内减弱,羟脯氨酸含量减少。结论急性放射性溃疡组织内胶原合成减少、纤维组织结构异常以及肌成纤维细胞数量减少与急性放射性皮肤溃疡收缩迟缓的机制有关。     

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的：观察细胞因子诱导成骨的共同信号分产核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，其成骨表型转变的可能性。方法：实验于2003-10／2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，成骨标志基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1 mRNA的表达采用反转录．聚合酶链反应检测，骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测，Cbfa蛋白的表达采用Western blot检测。结果：①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达，Ⅰ型胶原表达增强，说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达，显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Western blot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达，证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论：核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化，增加了成骨细胞数量，使成骨能力增强成为可能。     

表皮细胞水化对成纤维细胞及瘢痕挛缩的影响

目的：观测表皮细胞水化对成纤维细胞及瘢痕挛缩的影响，探索其作用机制，方法：以表皮细胞与成纤维细胞分层培养为研究模型，采用放免、免疫组化及图像分析等方法，观测对表皮细胞水化处理后，成纤维细胞形态、胶原合成及细胞因子表达的影响。结果：采用水化处理后，成纤维细胞胶原合成、转化生长因子－β1、转化生长因子－R（I）和α-SM actin阳性表达水平明显下降。结论：通过对表皮细胞的水化，可抑制成纤维细胞的胶原合成及瘢痕挛缩。     

肺成纤维细胞三维立体培养条件对肺纤维化组织重塑的影响

背景：组织细胞三维立体培养是肺纤维化破坏与组织收缩研究的理想模型,特别是在纤维化的进展过程中,几种细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、胰岛素以及渗出的血浆成分可能在纤维化的损伤修复和组织重塑中起重要的作用。目的：观察三维立体培养条件下肺成纤维细胞在血清和血清蛋白、胰岛素和细胞因子前列腺素E2、转移生长因子β、肿瘤坏死因子α的细胞外胶原基质收缩和细胞凋亡,探讨肺纤维化过程中细胞因子、胰岛素、血清及血清蛋白对肺组织重塑和纤维化形成的影响。设计：随机对照实验。单位：解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科。材料：实验于2005-08/2006-01在解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科实验室完成。人胚肺成纤维细胞（AmericanTypeCultureCollection）,DMEM培养液和胎牛血清（GIBCO）,胰岛素、转移生长因子（R＆D）,前列腺素E2（Sigma）,Ⅰ型胶原提取自大鼠尾部肌腱。方法：为观察初始浓度对成纤维细胞收缩力的影响及细胞数量对胶原收缩的影响,提取大鼠尾部的胶原,与双蒸水、4×DMEM及成纤维细胞混合成胶原含量为0.75-1.5g/L的立体组织胶原,细胞浓度为0.2×10^7-4×10^7L^-1,置入含体积分数0.05的CO2培养箱37℃培养。每天测定胶原的面积,最后计算终面积与初始面积的比值。将0.01%-0.5%血清、0.1%的血清白蛋白和0.1%球蛋白分别加入到培养液中,观察胶原的收缩。加入10mg/L转移生长因子、10mg/L白细胞介素1、1mmol/L胰岛素和0.1μmol/L前列腺素E2,观察细胞因子对成纤维细胞介导胶原收缩的影响,对胶原中DNA含量进行测定及细胞存活率检测。主要观察指标：不同细胞因子或血清成分对肺成纤维细胞介导胶原收缩的影响,胶原内成纤维细胞数量对胶原收缩的影响,以及不同浓度胶原对胶原收缩和对细胞增殖和凋亡的影响。结果：①胶原的收缩有细胞依赖性,细胞浓度越高则胶原收缩越强烈。②血清和白蛋白的加入引起了剧烈的胶原收缩。③转化生长因子和胰岛素增强胶原的收缩,前列腺素E和白细胞介素1抑制胶原的收缩。④胶原的初始浓度越低,胶原收缩的速度越快越强烈,胶原终面积就越小,其中的成纤维细胞凋亡就越多。结论：肺成纤维细胞介导的胶原收缩可被白细胞介素1和前列腺素E抑制,胰岛素和转化生长因子则促进了胶原收缩。血清及血清成分在受损肺组织的渗出可以导致肺组织胶原的稀释与强烈收缩,而导致成纤维细胞增殖的抑制和凋亡的增加,肺纤维化进一步发展,成为无细胞胶原成分。     

过表达PTEN对LPS诱导的成纤维细胞周期及胶原分泌的影响

目的探索过表达第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)对大肠杆菌细菌脂多糖(LPS)诱导的成纤维细胞(FB)周期及胶原分泌的影响。方法体外培养增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞,原代培养接近80%融合时消化传代,培养至第3代,采用0.5μg/mL的LPS刺激第3代正常皮肤成纤维细胞,将携带有PTEN基因的缺陷型腺病毒转染LPS刺激后的第3代正常皮肤成纤维细胞。采用流式细胞仪检测细胞周期,ELISA法检测细胞胶原分泌。结果过表达PTEN基因能够抑制LPS处理后成纤维细胞周期G2M期的增加。LPS刺激能够升高皮肤成纤维细胞中胶原的分泌,过表达PTEN能够抑制LPS诱导的细胞胶原的分泌。结论 LPS可增加成纤维细胞G2M期的数量,增加胶原分泌,过表达PTEN可阻断这种作用。     

血管平滑肌细胞表型改变与肿瘤抑制基因p21WAF1和p53的关系

目的增殖表型血管平滑肌细胞中肿瘤抑制基因p21WAF1基因和p53基因表达可能具有对抗血管平滑肌细胞的增殖能力,观察血管平滑肌细胞表型变化与肿瘤抑制基因p21WAF1和p53的关系.方法实验于2003-09/10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成.应用胶原酶消化法建立大鼠原代培养血管平滑肌细胞,去血清诱导体外培养血管平滑肌细胞分化.流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力,反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin表达变化,反转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹杂交方法检测p21 WAF1和p53基因表达变化.结果去血清培养后,原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降,DNA合成前期细胞明显增加[(48.38±2.35)%],细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白和calponin明显表达.肿瘤抑制基因p21WAF1和p53表达下降.在200 g/L血清培养后,大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛,DNA合成前期细胞相对较少[(28.80±1.58)%],细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白和calponin表达明显下调,肿瘤抑制基因p21 WAF1和p53表达显著增加.结论肿瘤抑制基因表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关.提示某些病理性增殖过程中肿瘤抑制基因的大量表达可能与其对抗细胞增殖的功能相关,并可能在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用.     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景：研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生。目的：构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。方法：根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况。结果与结论：测序分析结果显示：克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示：转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A（1156）为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48h可达45%。证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功。     

丹参酮ⅡA抑制心肌细胞的纤维化

背景：转化生长因子β-Smads信号通路是心肌纤维化的关键通路;丹参酮ⅡA具有抑制心肌纤维化作用.目的：验证丹参酮ⅡA对转化生长因子β1致心肌纤维化的作用并探讨其机制.方法：取出生24 h内的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞.取上述第3代心肌成纤维细胞,用5μg/L转化生长因子β1培养15,30,60,120 min或6,12,24 h后收集细胞,用不同浓度（10-5 mol/L、10-4结果与结论：转化生长因子β1在一定范围内以时间依赖方式诱导结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原、磷酸化Smad3及Smad7的表达,刺激终末结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原mRNA的表达量明显上升（均P 〈0.01）;磷酸化Smad3及Smad7蛋白表达量在刺激后1 h达到峰值,表达量显著增加（均P 〈0.01）.高浓度丹参酮ⅡA预处理可显著下调磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原表达（均P 〈0.01）.两种浓度的丹参酮ⅡA预处理均可上调Smad7蛋白表达（P 〈0.05,P 〈0.01）.提示丹参酮ⅡA对心肌纤维化有抑制作用,可能与其上调Smad7蛋白表达,抑制转化生长因子β1诱导的Smad3磷酸化,部分阻断转化生长因子β1-Smads信号通路有关. mol/L）丹参酮ⅡA预处理2 h后再加入5μg/L转化生长因子β1培养120 min或24 h后收集细胞,并设空白对照组.免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,Western Blot检测Smad7及磷酸化Smad3蛋白表达.免疫组织化学染色及免疫荧光法检测磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白表达.     

肌成纤维细胞和伤口收缩的关系（一）

创伤修复过程常伴随伤口收缩的瘢痕形成。大量研究表明肌成纤维细胞是引起伤口收缩的主要动力。这种细胞是成纤维细胞分化的一个特别阶段，兼有成儿平滑肌细胞的形态学、药理学和生化特征，能表达α－ＳＭａｃｔｉｎ，肌成纤维细胞短暂地存在于正常创伤愈合过程中，最后通过凋亡而消失，但长久地存在于肥厚性瘢痕中是肥厚性瘢痕致关节挛缩畸形的主要原因。     

血管平滑肌细胞增殖与转化生长因子β/smads的表达

目的:观察增殖和分化两种血管平滑肌细胞表型改变与转化生长因子β/smads信号传递的关系。方法:实验于2003-09/10哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠,常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0.2和0.05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基,37℃,体积分数0.05CO2进行培养,2.5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色,存活细胞数在98%以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态,抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。流式细胞分析检测不同表型血管平滑肌细胞增殖能力,蛋白质印迹分析方法检测血管平滑肌细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达变化,反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测转化生长因子βI型受体,smad2,smad3,smad4和smad7的表达变化。结果:①流式细胞分析及蛋白印迹分析方法检测发现,去血清培养后,原代培养大鼠血管平滑肌细胞增殖能力下降;DNA合成前期细胞明显增加犤(52.42±2.35)%犦,细胞分化基因平滑肌特异性α-肌动蛋白明显表达。体积分数为0.2胎牛血清培养后,大鼠血管平滑肌细胞增殖旺盛,DNA合成前期细胞数相对较少犤(17.23±1.58)%犦,细胞分化相关基因平滑肌特异性肌动蛋白表达明显下调。②反转录聚合酶链反应和细胞免疫荧光方法检测发现,去血清培养后的分化表型平滑肌细胞中,转化生长因子βI型受体表达增加,smad2和smad3表达无明显变化,smad4表达增加,smad7表达下降。而高血清培养诱导平滑肌细胞转化为增殖表型后,转化生长因子βI型受体表达下降,smad4表达下降,抑制型smad7表达增加,smad2和smad3表达无明显变化。结论:转化生长因子β/smads表达与血管平滑肌细胞表型状态密切相关。血管平滑肌细胞分化时,可能通过转化生长因子βI型受体/smad4调控细胞分化功能;而血管平滑肌细胞增殖时,细胞则可能通过smad7信号传导通路发挥作用。提示转化生长因子β/smads在血管平滑肌细胞由合成表型逆转为分化表型的分子调控中发挥作用。