荧光原位杂交技术在自然流产绒毛染色体核型检测中的应用

目的 探讨荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术在提高自然流产绒毛染色体核型分析准确性和异常核型检出率中的作用.方法 采用18、X、Y染色体着丝粒探针和13、21及16、22染色体单一序列探针,对100例自然流产绒毛标本同时进行FISH检测和常规染色体核型分析,比较并分析2种方法的一致性及差异.结果 (1)染色体核型分析:100例流产绒毛标本培养成功率为89.0％(89/100).检出异常核型51例,异常核型检出率为57.3％(51/89),其中常染色体非整倍体37例、性染色体非整倍体4例、三倍体2例、四倍体1例,还有1例核型为68,XX,结构异常6例.(2) FISH技术检测:100例流产绒毛标本均获得FISH结果,成功率为100.0％.共检出38例染色体异常,异常核型检出率为38.0％(38/100),其中常染色体非整倍体25例、性染色体非整倍体5例、三倍体3例,还有1例13、16、18、21、22号染色体均为三倍体,嵌合体4例.(3)核型分析与FISH结果的异同:在绒毛标本培养失败的11例中,FISH检测出染色体异常2例,占18.2％(2/11);核型为46,XY者中FISH检测出3例非整倍体嵌合体;核型为46,XX者中FISH检测出染色体异常2例.FISH能检测出的染色体异常占所有染色体异常核型的65.5％(38/58).结论 FISH技术能简便、快速的检测自然流产绒毛染色体非整倍体数目异常,联合常规染色体核型分析能提高染色体核型分析的准确性和异常核型的检出率.     

多重连接依赖探针扩增技术在稽留流产绒毛组织染色体核型分析中的应用

目的 探讨多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在稽留流产绒毛组织染色体核型分析中的应用.方法 选择2008年2-10月于深圳市妇幼保健院就诊,经激素水平测定、B超和临床检查确诊为稽留流产患者91例为病例组;随机抽样方法选择同期20例经激素水平测定、B超和临床检查为正常妊娠,要求人工流产者为对照组.人工流产术中无菌条件下获取两组妇女的绒毛组织,培养后每份样本分别采用传统细胞遗传学G显带染色体核型分析方法、同时提取DNA采用MLPA技术分析染色体异常,并与传统染色体核型分析结果进行比较.结果 91例病例组样本中,有84例(92%)采用MLPA技术进行染色体核型分析的非整倍体结果与传统染色体核型分析方法的结果一致,其中包括正常核型40例、常染色体三体29例、常染色体双三体1例、X染色体单体合并常染色体三体1例、X染色体单体10例、嵌合性X染色体单体2例和1例结构异常46,XX,der(5)t(5;8)(p1.2;q1.2);其余结果不一致的7例中,采用传统染色体核型分析方法检测出2例三倍体和5例四倍体,而采用MLPA技术检测结果均为正常的二倍体.20例对照组样本两种技术的分析结果均一致.结论 MLPA技术分析染色体非整倍体异常是一种简单、快速且有效的方法,具有临床实际应用价值.     

早期自然流产绒毛组织SNP-array遗传学诊断研究

目的:初步探讨单核苷酸多态性阵列(SNP-array)在早期流产绒毛遗传学诊断中的临床应用价值。方法:选取临床诊断为早期自然流产的82例患者,刮宫术后获取绒毛组织,行常规绒毛细胞培养G显带核型分析,并同时提取绒毛组织DNA进行SNP-array检测,比较两者的检测结果。结果:常规绒毛细胞培养G显带核型诊断成功率87.8%(72/82),SNP-array诊断成功率为100%(82/82)。G显带分析获得结果 72例,核型正常35例,核型异常37例,异常率51.4%(37/72)。82例SNP-array分析结果中,核型正常30例,核型异常52例,异常率63.4%(52/82)。G显带分析失败的10例标本中,SNP-array检出6例异常;G显带与SNP-array结果不符的12例中,包括2例全基因组单亲二倍体(uniparental disomy,UPD),2例是部分染色体UPD。结论:SNP-array技术具有高准确性、高通量、快速检测等优点,在自然流产绒毛遗传学分析中具有较强的临床应用价值。     

两种不同遗传学分析方法用于诊断自然流产组织的比较

目的探讨比较基因组杂交（CGH）技术与绒毛细胞培养染色体核型分析用于自然流产组织遗传学诊断的准确性。方法选择妊娠49—91d的自然流产患者38例,在无菌条件下经宫颈取绒毛,其中难免流产的新鲜组织标本27份,过期流产的陈旧组织标本11份。每份组织标本均采用绒毛细胞培养染色体核型分析,并同时采用CGH技术对全基因组进行分析。结果CGH技术诊断成功率为100％（38／38）,而绒毛细胞培养染色体核型分析诊断成功率为82％（31／38）。两种方法的诊断符合率为90％（28／31）,在3例出现不同诊断结果的病例中,1例绒毛细胞培养染色体核型分析显示染色体核型正常,而CGH技术显示3q^22_q^24缺失;另2例绒毛细胞培养染色体核型分析为3倍体,但CGH技术诊断结果显示正常。在7例绒毛细胞培养失败而仅有CGH技术诊断结果者中,3例为染色体非整倍体异常,另4例正常。结论CGH技术用于诊断自然流产组织是可行的。绒毛细胞培养染色体核型分析比较,CGH技术诊断成功率高,且对非平衡染色体结构重排的诊断有较高的敏感性,可以作为绒毛细胞培养染色体核型分析的补充方法。     

自然流产与绒毛中维甲酸X受体α基因突变关系的研究

目的 :探讨人类自然流产与绒毛中维甲酸X受体α(RXRα)基因突变的关系。方法 :用PCR SSCP 银染法和DNA测序法检测了自然流产 5 0例和正常早孕要求人工流产4 0例的胚胎绒毛组织中RXRα基因的外显子 2～ 10的突变。结果 :4 9例患者和正常对照组绒毛组织中RXRα基因的各个外显子在PCR SSCP 银染检测中均未显示异常。 1例患者SSCP 银染中显示异常的第 9外显子序列经DNA测序后未发现突变。结论 :目前尚不能认为人类自然流产与绒毛中RXRα基因突变有关     

自然流产患者绒毛组织中致死基因mRNA的表达

目的　探讨自然流产患者绒毛组织中致死基因维甲酸受体 (RXR)α、N myc和转录增强因子 1(TEF 1)mRNA的表达水平。方法　采用逆转录聚合酶链反应技术 ,对 3 8例自然流产患者的绒毛组织中RXRα、N myc和TEF 1基因mRNA的表达水平进行检测 ,并和 3 3例正常早孕妇女对比。结果　 ( 1)RXRα和TEF 1基因mRNA表达水平 ,自然流产患者分别为 0 4± 0 3和 1 6± 1 1,正常早孕妇女分别为 0 6± 0 3和 2 3± 1 2 ,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;N myc基因mRNA表达水平分别为 2 1± 1 2和 2 2± 0 9,两者比较 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。 ( 2 )复发性流产者 ( 2 3例 )与非复发性流产者 ( 15例 )的RXRα基因mRNA表达水平分别为 0 3± 0 2和 0 6± 0 4(P <0 0 5 ) ,TEF 1基因mRNA表达水平分别为 1 0± 1 1和 1 9± 1 2 (P <0 0 5 )。结论　RXRα、TEF 1基因可能参与调控人类胚胎的生长 ,其表达水平降低可能与自然流产尤其是复发性流产有关     

cFLIP在早期自然流产绒毛组织的表达及意义

目的:检测早期正常妊娠及自然流产绒毛组织中细胞凋亡抑制蛋白cFLIPmRNA及其蛋白产物的表达,分析并探讨cFLIP与自然流产的关系。方法:应用RT-PCR法及免疫组化SP法检测cFLIP mRNA及其蛋白产物在20例自然流产患者(研究组)绒毛组织的表达,以同期正常妊娠要求人工流产20例为对照组。结果:研究组绒毛组织中cFLIP mRNA及蛋白表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:细胞凋亡抑制蛋白cFLIP参与维持正常妊娠,绒毛组织中其表达下降可能在自然流产的发生中起重要作用。     

FISH快速检测自然流产绒毛染色体非整倍体异常的临床价值

目的:探讨应用荧光原位杂交技术(FISH)对早期自然流产绒毛染色体非整倍体检测的临床价值。方法:对30例因自然流产行清宫术的绒毛组织行FISH分析,使用7种探针对13、16、18、21、22号和X、Y染色体进行了检测,并对这30例流产夫妇行外周血淋巴细胞染色体常规核型分析。结果:FISH分析的30例自然流产的绒毛组织中,有17例检测出了异常信号,检出率为57%,其中8例16-三体、2例22-三体、2例13-三体和5例三倍体。30例自然流产夫妇外周血淋巴细胞染色体核型未见异常。结论:FISH技术可以快速、简便地检测出流产物绒毛组织染色体非整倍体的异常,FISH技术的应用可以为自然流产夫妇遗传咨询提供重要的信息。     

唐氏综合征的产前诊断分子技术研究进展

唐氏综合征是人类常见的染色体疾病，经典的细胞遗传学方法是诊断唐氏综合征的金标准，但其局限性不适合大规模的产前诊断。随着分子细胞遗传学技术发展，荧光原位杂交技术（FISH）、定量荧光PCR（QF-PCR）、微阵列-比较基因组杂交（Array CGH）、多重连接探针扩增技术（MIJPA）、引物原位标记技术（PRINs）等被用于唐氏综合征快速产前诊断，各种方法各有优劣，改进后会大力推进唐氏综合征的产前诊断速度和准确性。     

早期自然流产患者绒毛Notch受体mRNA和蛋白表达及与妊娠关系的初步探讨

目的:初步探讨早期自然流产患者绒毛Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)mRNA及蛋白表达及对滋养细胞的调控作用。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术和免疫印迹法检测6例自然难免流产患者和12例正常早期妊娠妇女绒毛Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的mRNA和蛋白的表达水平。结果:(1)自然流产组绒毛Notch1和Notch3 mRNA表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05);(2)Western-blot检测显示早期自然流产患者绒毛中Notch1、Notch2、Notch3受体蛋白的表达水平高于正常早期妊娠组(P<0.05)。结论:Notch受体蛋白在早期自然流产患者绒毛中表达上调,可能与自然流产的发病原因有关。     

组蛋白去乙酰化酶1蛋白在早期自然流产绒毛和蜕膜组织中的表达

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白在早期自然流产发生中的病理生理作用及临床意义。方法:应用免疫组织化学和Western blot法检测早期自然流产和早期正常妊娠者绒毛及蜕膜组织中HDAC1蛋白的表达。结果:免疫组化示:HDAC1主要定位于绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞和子宫蜕膜细胞、腺上皮细胞的胞核;早期自然流产绒毛组织中HDAC1的表达强度低于早期正常妊娠组,而蜕膜组织中,早期自然流产组织HDAC1的表达强度高于正常妊娠组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。Westernblot示:早期自然流产绒毛组织中HDAC1蛋白的相对表达量为1.38±0.63,明显低于正常妊娠组(1.92±0.82),差异有统计学意义(P<0.05);而早期自然流产蜕膜组织中HDAC1蛋白的相对表达量为1.02±0.53,明显高于正常妊娠组(0.71±0.36),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HDAC1在早期自然流产绒毛和蜕膜组织中的异常表达可能在早期自然流产的发生、发展中起重要作用。     

白血病抑制因子在正常早孕、先兆流产及难免流产患者绒毛组织中的表达

目的测定白血病抑制因子(LIF)在正常早孕、先兆流产及难免流产患者绒毛组织中表达的差异,探讨LIF在先兆流产及难免流产发病中的作用。方法采用放射免疫法检测正常早孕妇女(正常早孕组,30例)、先兆流产患者(先兆流产组,30例)及难免流产患者(难免流产组,30例)血清孕酮及人绒毛膜促性腺激素(hCG)水平;采用免疫组化技术———链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)法对LIF在3组妇女绒毛组织中的表达进行组织学定位和半定量分析;采用蛋白印迹法对3组妇女绒毛组织中LIF的相对表达量进行测定。结果(1)血清孕酮及hCG水平在正常早孕组、先兆流产组及难免流产组分别为(95±26)、(90±26)、(36±17)nmol/L及(75±14)、(68±13)、(13±3)kU/L。正常早孕组与先兆流产组血清孕酮及hCG水平分别比较,差异均无统计学意义(P>0·05);而难免流产组与其他两组妇女血清孕酮及hCG水平分别比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(2)3组妇女绒毛组织中LIF均呈现阳性表达,阳性染色主要位于滋养细胞胞质中,胞核无明显着色。(3)正常早孕组、先兆流产组及难免流产组LIF相对表达量分别为1·17±0·13、1·06±0·10、0·30±0·02,难免流产组与其他两组分别比较,差异均有统计学意义(P<0·01),而正常早孕组与先兆流产组比较,差异无统计学意义(P>0·05)。结论LIF对妊娠的正常维持有一定的保护作用,LIF在早孕绒毛组织中的低表达,可能与hCG及孕酮水平下降有关,是导致难免流产的原因之一。     

正常与药物流产绒毛蜕膜组织细胞凋亡及相关基因的表达

目的：探讨米非司酮对早孕绒毛蜕膜细胞调亡、增殖及相关基因表达的影响。方法：对正常早孕绒毛与蜕膜、药物流产完全与不完全的绒毛、药物流产不完全蜕膜标本各10份（共50份标本）,应用原位末端标记法进行细胞凋亡的组织学检测,免疫组织化学方法测定bcl-2、bax、fas、增殖细胞核捩的（PCNA）5种蛋白在组织中的分布与含量,同时应用原位杂交法测定fas与fasL mRNA的分布与含量。结果：正常早孕绒毛中存在少量凋 细胞,主要分布于合体滋养细胞,蜕膜中凋亡细胞偶见;绒毛蜕膜中均可检测到上述5种蛋白。米非司酮药物流产的绒毛合体滋养细胞凋亡显著增,蜕膜凋亡细胞也增多,同时伴有促凋亡baz、fas、fasL蛋白及fas、fasL、mRNA含量的增加,而PCNA蛋白含量无减少。结论：米非司酮能促进早孕绒毛合体滋养细胞,蜕膜间质及腺上皮细胞的凋亡,且主要通过fas与fasL转录及翻译途径介导,bax表达增加也有一定相关性,此可能为其抗早孕机理之一。     

不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交检测结果的影响

目的 探讨不同扩增方法和探针长度对植入前单个卵裂球比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)检测结果的影响,为植入前产前诊断奠定基础.方法 随机将20枚植入前6～8细胞期胚胎卵裂球分为A和B组(各10枚),取1名正常男性外周血20枚淋巴细胞,分为C和D组(各10枚)作为对照.A和C组经简并寡聚核苷酸聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction,DOP-PCR)、B和D组经多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)分别进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),用上述全基因组扩增产物进行PCR扩增TBX1基因2号外显子,验证其特异性.将获得的WGA产物制备成250～750 bp和750～2000 bp 2种不同长度的探针与正常男性中期染色体核型进行杂交,Y染色体性别决定区(sex-determining region of Y,SRY)基因验证CGH检测结果.结果 (1)用DOP-PCR扩增时,A组10枚卵裂球中有9枚WGA成功,C组10枚淋巴细胞WGA均成功;但其扩增产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,出现较多非特异性条带.CGH检测中.5例卵裂球用长度250～750 bp的探针检测时,1例失败,1例CGH软件核型分析结果与SRY结果不一致.(2)经MDA的B和D组,均WGA成功;其产物进一步扩增TBX1基因2号外显子时,非特异性条带少.CGH检测中,探针长度为250～750 bp的5例卵裂球均检测成功,且与SRY验证结果一致.(3)用长度为750～2000 bp探针检测时,杂交效果不好.结论 单卵裂球全基因组扩增,MDA较DOP-PCR方法稳定,特异性强,CGH检测中,扩增产物酶切至250～750 bp制备的探针杂交图像均匀、清晰,软件分析核型结果稳定、准确.

Abstract：

Objective To investigate the effect of different amplification methods and probes with various length on the results of comparative genomic hybridization (CGH) analysis of pre-implanted single blastomere and to establish the basis for preimplantation genetic diagnosis.Methods Twenty blastomeres of embryo at 6-8 cells stage were randomly divided into A and B group with 10 in each.Twenty peripheral blood lymphocytes from a healthy man were similarly divided into C and D group with 10 in each.Degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction (DOP-PCR) was used to amplify whole genomic DNA in group A and C,and multiple displacement amplification (MDA) was used in group B and D for whole genome amplification (WGA).The specificity of resultant products was confirmed by amplification of TBX1 gene exon 2.CGH was performed respectively with 250-750 bp and 750-2000 bp probes prepared from the amplified whole genomic DNA.The result of CGH was verified by sex-determining region of Y (SRY).Results (1) Nine of the 10 samples in group A and all in group C were amplifiable by DOP-PCR,but there were multiple non-specific bands in the amplification of TBX1 exon 2 when WGA products were used as templates.When 250～750 bp probe was used in CGH,1 of the 5 blastomeres was failed and another one had different karyotype from that analyzed by SRY.(2) All samples in group B and D were successfully amplified by MDA,and the non-specific bands were significantly less in the amplification of TBX1 exon 2.All 5 blastomeres were successful in CGH with the 250～750 bp probe.Moreover,the karyotype was in agreement with that of SRY.(3) When 750 ～ 2000 bp probe was used,the CGH results were suboptimal.Conclusions In WGA of single blastomere,MDA is superior to DOP-PCR in the stability and specificity.The karyotype image detected by CGH with the 250～750 bp probe is clear and homogenous.     

不同年龄和流产次数的复发性流产患者绒毛染色体核型分析

目的:了解复发性自然流产胚胎染色体异常发生情况。方法:2008年1月至2011年12月,在我院诊治并成功行绒毛染色体核型分析的自然流产患者235例,根据自然流产次数分为复发性流产组(125例)和偶发性流产组(110例)。比较两组绒毛染色体异常发生率和类型的差异,不同流产次数的胚胎染色体异常发生情况,以及不同年龄患者绒毛染色体异常的发生情况。结果:复发性流产组,绒毛染色体异常发生率显著低于偶发性自然流产组(47.2%vs 70.9%,P<0.05)。复发性流产组中三体占异常染色体的66.1%(39/59),显著高于偶发性流产组(44.8%,35/78)(P<0.05)。随着自然流产次数的增加,绒毛染色体异常发生率降低,差异有统计学意义(χ2=15.266,P=0.004)。复发性流产组中,年龄≥35岁者的绒毛染色体异常发生率明显高于年龄<35岁者(60.9%vs39.2%,P<0.05)。偶发性自然流产组中,年龄≥35岁者的绒毛染色体异常发生率亦明显高于年龄<35岁者(88.9%vs 62.2%,P<0.05)。结论:胚胎染色体异常是引起复发性流产的一个重要原因,随着流产次数的增加,流产胚胎染色体异常的发生率降低。无论是复发性流产还是偶发性流产,高龄均是引起胚胎染色体异常的高危因素。     

Expression of FK506-binding protein 52 (FKBP52) in chorionic villi with early recurrent spontaneous abortion

Objective: To investigate the mRNA and protein expression of FK506-binding protein 52 (FKBP52) in the chorionic villi of patients with recurrent spontaneous abortion (RSA) and normal women during early pregnancy.

Methods: Fresh chorionic villus tissues were collected from 60 subjects. A total of 30 patients with a history of RSA were enrolled into the RSA group and 30 normal pregnant women were enrolled into the control group. The FKBP52 mRNA expression levels in chorionic villi of the RSA patients and healthy controls were measured via semiquantitative RT-PCR. The protein distribution and expression levels of FKBP52 in chorionic villi were analyzed through immunohistochemistry (IHC). The correlation between FKBP52 expression and RSA was analyzed.

Results: We demonstrated that FKBP52 mRNA is expressed in chorionic villi samples of normal pregnancy and RSA. RSA patients exhibited significantly lower FKBP52 gene expression levels compared with those in normal pregnancies (p?<?0.05). FKBP52 immunoreactivity in chorionic villi was mainly observed in trophoblast cell cytoplasm. The FKBP52 protein expression levels in the chorionic villi of RSA patients was significantly lower than in normal women during pregnancy (p?<?0.05).

Conclusions: FKBP52 protein levels were decreased in the chorionic villi of RSA patients, which indicate that the decrease in FKBP52 may be associated with RSA. The low FKBP52 mRNA expression level, which is consistent with the IHC result, may affect embryonic development and even lead to abortion. FKBP52 may be involved in the pathogenesis of RSA and new therapies that increase the FKBP52 expression may help treat RSA.     

复发性流产病人绒毛组织中FK506结合蛋白52的表达及意义

目的 探讨复发性流产（RSA）病人及正常早孕妇女绒毛组织中FK506结合蛋白52（FKBP52）基因和蛋白的表达。方法　 选取2012年2月至2013年6月广西医科大学第一附属医院妇产科门诊就诊的30例RSA妊娠妇女（复发性流产组）及同期正常早孕妇女30例（对照组）,收集其新鲜绒毛组织,分别应用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学方法检测两组绒毛组织中FKBP52 基因和蛋白的表达。结果　 FKBP52在两组妇女的绒毛组织中均有表达,但与对照组相比,复发性流产组凝胶成像系统半定量分析FKBP52 mRNA（1.484 ± 0.198对1.109 ± 0.292,P<0.05）及蛋白表达（91.8 ± 5.3对68.2 ± 8.4,P<0.01）均明显降低。结论　 FKBP52的表达可能在胚胎着床和早期妊娠的维持中起重要作用,其表达降低可能与RSA的发病密切相关。