定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用

随着热稳定ＤＮＡ多聚酶的发现,聚合酶链反应(ＰＣＲ)技术发生了革命性的飞跃,使得其应用于临床成为可能,为医学检验及其研究提供了新的手段。已用于临床的ＰＣＲ方法至今大都为定性分析,既无标准对照,也无质控,其最终产物用电泳法鉴定容易产生非特异性条带,结果重复性差,可靠性低,因而给临床诊断带来混乱。由于定性没有量化指标,所以无法用于疾病随访和疗效观察。如何提高灵敏度和稳定性,并能对样品中的ＤＮＡ和ＲＮＡ进行定量分析是迫切需要解决的课题。一、目前临床采用的几种ＰＣＲ定量测定方法1固体捕获技术的运用。(1)ＰＣＲ酶联化学…     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法,为快速、准确地定量检测恶性疟原虫奠定基础。方法 根据恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将ＰＣＲ扩增的恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板用于标准曲线的制定和样品检测。结果 应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与反浓度具有良好的线性关系,相关系数为０．９９８。检测恶性疟血样     

白细胞介素3竞争性逆转录-聚合酶链反应方法的建立及初步应用

传统的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术难以对待测样品中ｍＲＮＡ进行定量分析。为克服ＲＴＰＣＲ的这种不足,９０年代初Ｇｉｌｉａｎｄ等建立了竞争ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ）方法［１］,从而使得快速、敏感地定量研究ｍＲＮＡ成为可能。关于...     

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测IL—6mRNA

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录－聚合酶链反应－微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL－6mRNA的方法。方法：从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA，进行RT－PCR扩增，PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交，用链亲和素－辣根过氧化物酶（SAV－HRP）及底物系统检测杂交信号。结果：该方法检测IL－6mRNA的灵敏度明显高于逆转录－聚合酶链反应－琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT－PCR和酶联夹心杂交均无非特异性阳性信号出现；重复性良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于细胞因子mRNA的定量检测。     

反转录聚合酶链反应检测血液标本癌胚抗原mRNA诊断消化系统恶性肿瘤

目的 探讨癌胚抗原mRNA（CEA－mRNA）在诊断与鉴别诊断消化系统恶性肿瘤价值。方法 以54例消化道恶性肿瘤患者（肿瘤组）和42例非恶性肿瘤的良性道患者（非肿瘤组）为研究对象,应用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测血液标本CEA－mRNA。结果 血清标本CEA－mRNA阳性检测结果为恶性肿瘤组31例（57．4％）,非肿瘤组1例（2．4％）,两组阳性结果的差异具有显著性（P＜0．01）。血液标本RT－PCR检测CEA－mRNA指标诊断恶性消化系统肿瘤的特异性为97．5％、敏感性为57．4％。结论 在诊断与鉴别诊断消化系统恶性肿瘤等方面,CEA－mRAN是一个特异性和敏感性比较好且很实用的指标,可以常规应用。     

竞争性聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA

定量检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的现有方法主要是分子杂交法，敏感性为０．１～１ｐｇ，不能达到病毒最低感染水平。聚合酶链反应技术有极高的特异性，灵敏度可达１ｆｇ，相当于３×１０２个病毒颗粒。定量ＰＣＲ技术为研究病毒与疾病关系提供了强有力的手段。本文应用竞争性ＰＣ...     

聚合酶链反应检测丁型肝炎病毒方法的建立及初步应用

目的:研究建立聚合酶链反应(PCR)检测丁型肝炎病毒的方法,并在临床上作初步应用.方法:选择HDV保守区域基因片段设计合成特异性引物,建立检测HDV感染的PCB方法,对450例门诊患者血清进行HDV感染检测.结果:该PCR方法特异性和灵敏度均较高,450例门诊患者血清HDV感染率为1.3%,与ELISA法比较,总符合率为99.3%.结论:本PCR方法可用于检测HDV感染,是一种快速、简便、实用的方法.     

竞争性定量聚合酶链反应的评价

聚合酶链反应（PCR）用于定量研究是该项技术的一大难点，因为常规PCR只能给出阳性或明性结果。虽然从理论上讲，扩增产物的星与初始模板浓度呈现指数关系，但实际上由于临床标本中抑制物的存在及PCR过高的敏感性，可使同一份标本的DNA样品在不同管中扩增会得出完全不同的结果，即所谓的“试管效应””’。为了解决这一问题，许多作者采用同一管中共同扩增内参照模板，即所谓的差别PCR等‘”。该方法的最大缺点是，内参照模板和待测定的靶序列性质不同，需要选用不同的引物，两者的扩增效率可能完全不同，且只能给出相对含量，不能求…     

用聚合酶链反应技术检测急性髓细胞白血病

应用一对引物通过逆转录酶／聚合酶链反应扩增１７例急性髓细胞白血病患的ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合转录本，１２例初治患中一致性扩增到预期的２００ｂｐ大小的片段，其中７例证实有典型ｔ（８；２１）易其变异型。扩增片段大小及其限制性内切酶谱提示ｔ（８；２１）易位的ＡＭＬ１和ＥＴＯ基因断裂点局限于一个内含子。５例Ｍ２已完全缓解２－３８个月仍检测到相同的ＡＭＬ１－ＥＴＯ融合ｍＲＮＡ，提示体内仍残存少量ｔ（８；２１     

聚合酶链反应检测肺炎衣原体方法的建立与初步应用

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在肺炎衣原体检测中的应用。方法参照Ｃａｍｐｂｅｌ报道的肺炎衣原体全基因序列、Ｇ＋Ｃ比例和次级结构设计一对引物，采用ＰＣＲ法检测肺炎衣原体ＤＮＡ及临床标本中的肺炎衣原体感染。结果经对肺炎衣原体、沙眼衣原体、大肠埃希菌、溶血性链球菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌培养物进行ＰＣＲ扩增，结果只有肺炎衣原体出现单一４３７ｂｐ的扩增区带；敏感性试验可检测出１０ｆｇ的肺炎衣原体ＤＮＡ；１０份模拟标本均扩增出４３７ｂｐ区带；２２份小儿肺部感染的咽拭子标本中有５份为阳性，阳性率为２２．７％，而显微镜检查只有２例可见包涵体；１２份正常小儿咽拭子标本均为阴性。结论ＰＣＲ法检测肺炎衣原体，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为肺炎衣原体感染的临床诊断提供了科学的依据     

逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法半定量检测人白细胞介素-6 mRNA

白细胞介素 6 (Ⅱ 6 )ｍＲＮＡ的表达高低 ,与临床疾病有极为密切的关系。目前定量检测ＩＬ 6ｍＲＮＡ主要采用实时聚合酶链反应 (ＰＣＲ)方法 ,但该方法需要实时ＰＣＲ仪和昂贵的荧光标记探针[1] 。本研究建立的逆转录 (ＲＴ)ＰＣＲ 酶联夹心杂交方法 ,能灵敏、特异、精确、简便地对人ＩＬ 6ｍＲＮＡ进行半定量分析。一、材料和方法1.主要试剂 :ＲＴ ＰＣＲ体系、链亲和素 辣根过氧化物酶结合物 (上海生工生物工程公司 ) ,ＤＮＡ结合微孔板 (ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ公司 ) ,杂交试剂自配[2 ] 。2 .引物、探针设计与合成 :( 1)引物序…     

定量聚合酶链反应测定技术

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)现已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。由于ＰＣＲ是对原始待测模板核酸的一个扩增过程 ,任何干扰ＰＣＲ指数扩增的因素都会影响扩增产物的量 ,使得ＰＣＲ扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系 ,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来 ,研究人员为克服上述影响因素 ,研究了各种相对准确的定量ＰＣＲ方法[1 3] 。一、ＰＣＲ扩增的理论模式在ＰＣＲ中 ,随着扩增周期的增加 ,模板以指数方式进行扩增。每一扩增周期后产物的量可用下式表达 :Ｙｎ=Ｙｎ - …     

特定mRNA的定量检测

本文概述了常用的特定基因转录产物ｍＲＮＡ的定量检测方法，并比较了各自的特异性，灵敏度，主要优缺点和影响因素，尤其对新出现的基于ＲＴ－ＰＣＲ的各种定量法作了分析比较。     

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γmRNA表达水平

目的　建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白 2γ(MIP 2γ)mRNA表达水平 ,并对方法进行评估。方法　TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA的表达。结果　线性检测范围达 6个数量级 ,最低检测下限为 6× 10 2 拷贝 ,最高检测上限为 6× 10 7拷贝 ,批间及批内变异 <12 2 %。正常Balb/c小鼠心脏、肝脏、肾脏组织均可检测到MIP 2γmRNA表达 ,以心脏表达水平最高。结论　采用TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA表达水平准确、特异、灵敏、快速、操作简便 ,具有临床推广价值。     

反转录聚合酶链反应检测癌胚抗原信使核糖核酸诊断消化道恶性肿瘤

目的：通过分析不同病变组织表达癌抗原信使核糖核酸（CEA－mRNA)的差异，探讨CEA－mRNA指标诊断消化道恶性肿瘤的应用价值。方法：以35例消化道恶性肿瘤患者和12例非恶性肿瘤的良性消化道疾病患者为研究，收集新鲜肿瘤组织及其癌旁正常组织和非恶性肿瘤组织以及同体血液为检测标本，应用套式反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测组织标本中CEA－mRNA，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血液标本癌胚抗原（CEA）。结果：恶性消化道肿物患者瘤组织标本29例（82．9％）表达CEA－mRNA，血液标本15例（42．9％）表达CEA－mRNA，两个指标表达情况相比具有显著性差异（P＜0．01），癌旁正常组织非癌病理组织也分别检测4例和1例表达CEA－mRNA阳性结果：组织标本CEA－mRNA指标诊断恶性消化道肿瘤的特异性为95．0％，敏感性为82．9％，结论：在诊断消化道恶性肿瘤方面，CEA－mRNA是特异性和敏感性较好且很实用的指标之一，可以常规应用。     

定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值

随着分子生物学技术的发展 ,聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断 ,如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、遗传性疾病的基因序列、人类白细胞表面抗原 (ＨＬＡ)配型、法医学方面的鉴定工作等。目前基因芯片的问世 ,将分子生物学技术又推向一个新的高潮。现就临床实验室开展ＰＣＲ技术及ＰＣＲ技术检测病原微生物及肿瘤基因的临床意义和定量ＰＣＲ技术 ,谈谈我们的看法。1.目前国内临床实验室应用ＰＣＲ技术存在的问题 :在设施方面 ,如仪器显示的温度与孔内的温度不一致 ,有孔内差…     

自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。