低温保存下异搏定对人肝细胞保护作用的实验研究

我们应用钙离子通道阻滞剂异搏定 (ＶＰ)保存成人分离培养的肝脏细胞 ,研究异搏定的保护作用机制 ,明确异搏定的具体作用途径。一、材料和方法1.成人肝脏细胞的分离和培养 :临床行同种异体肾移植时联合切取肝脏 ,以 4℃ＵＷ液 (ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓ ｃｏｎｓｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ)保存 1ｈ。切取肝叶组织 ,剪碎 ,加入胶原酶消化。取出细胞悬液过滤 ,滤液离心弃上清 ,加入ＵＷ液保存。台盼蓝染色 ,计数细胞存活率。2 .细胞内钙的测定 :(1)将肝细胞悬液分为 2组 ,每组又分为 4个小组(ｎ =5 ) ,第 1组分别为含 0ｍｍｏｌ/ＬＣａＣｌ…     

劈离式肝移植一供两受的报告

我院于 2 0 0 2年 7月 1 9日行劈离式肝移植治疗终末期肝硬化和Ｗｉｌｓｏｎ病 (肝豆状核变性 )各一例 ,现报告如下。临床资料　　 1 .供体手术　　供体血型Ａ型。按快速取肝法获取尸肝 ,采用双灌注方法 (即腹主动脉和门静脉 ) ,先以 0～ 4℃Ｃｏｌｌｉｎ液分别灌注含肝素 50 0 0 0ＩＵ的 2 50 0ｍｌ和 1 50 0ｍｌ,接着用 4℃的ＵＷ液经门静脉灌注 ,然后置肝脏于ＵＷ液中保存。热缺血时间为 6ｍｉｎ ,手术历时 35ｍｉｎ ,切取肝脏重量 1 0 80 ｇ。　　 2 .肝的分离和修整　　用ＣＵＳＡ沿肝脏镰状韧带的左侧劈离肝脏 ,一半为Ⅱ、Ⅲ段 ,重量 …     

应用旋转生物反应器和微载体技术体外大规模扩增人骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞 (ＭＳＣｓ)因其自身所具有的特殊性而日益受到关注[1,2 ] 。我们采用微载体技术在旋转生物反应器内扩增人骨髓间充质干细胞。一、材料与方法1.试剂 :细胞培养基ＤＭＥＭ购自美国Ｇｉｂｃｏ公司 ;旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ公司。2 .ＭＳＣｓ的分离与培养 :骨髓来源于正常献髓者 ,将人骨髓经ＤＭＥＭ稀释后用一种细胞分离液Ｐｅｒｃｏｌｌ分离 ,Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液的比重为 10 73 ｇ/Ｌ。分离后收获单个核细胞 ,ＤＭＥＭ洗 2次 ,接种于 2 4孔板内 ,浓度为 2 .0× 10 5个 /ｃｍ2 ,各孔内加入 10 %胎牛血清 …     

低温保存条件下人肝细胞钙超载途径的研究

细胞内钙超载是导致细胞缺血再灌注损伤的主要原因,对人肝细胞低温保存下钙超载途径的研究报道不多,现有的研究中,对钙超载的途径尚无统一认识。本实验针对这一问题进行了探讨。一、材料和方法1.成人肝细胞的分离和培养:临床行同种异体肾移植时,联合切取肝脏,以4℃ＵＷ液保存。切取灌洗较好的肝叶组织于培养皿中,用剪刀将组织剪碎,收集于锥形瓶中,加入胶原酶10ｍｌ,37℃水浴消化。取出细胞悬液,400μｍ滤网过滤,滤液吹打后加入红细胞裂解液3ｍｌ,1000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,弃上清液,加入保存液10ｍｌ,吹打均匀,37℃孵箱保存。取1ｍｌ细胞悬…     

多聚四氟乙烯膜高密度培养肝细胞的可行性及其对培养肝细胞代谢功能影响的研究

肝移植已在急性肝功能衰竭 (ＡＨＦ)的治疗中取得了满意的疗效 ,但其医疗费用昂贵 ,存在着严重的免疫排斥反应 ,且供肝来源受限[1] 。为此 ,我们对多聚四氟乙烯 (ＰＴＦＥ)膜用作生物人工肝材料高密度培养肝细胞的可行性及其对培养肝细胞代谢功能的影响进行了研究。1 材料与方法 :取非编织型同心圆状排列的ＰＴＦＥ膜 10 0ｃｍ2 高温消毒 ,Ｈａｎｋｓ液洗涤备用。 6～ 8周Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,采用改良Ｓｅｌｇｅｎ法 (胶原酶灌注 )分离肝细胞 ,台盼篮拒染试验检测肝细胞活性 ,85 %以上成活者用于实验。取含 3× 10 9肝细胞悬液稀释于 70 0ｍ…     

内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖

血管移植或动脉腔内成形术后 ,常因内膜增厚致血管再狭窄。内皮素 (ＥＴ)在内膜增生中有重要的促分裂效应。我们设计合成含 18ｂｐ的内皮素Ⅰ型受体(ＥＴＡ)和内皮素Ⅱ型受体 (ＥＴＢ)反义寡聚核苷酸 (ＯＤＮｓ) ,探讨ＯＤＮｓ对平滑肌细胞 (ＳＭＣ)上ＥＴ受体 (ＥＴＲ)蛋白表达和ＳＭＣ增殖的影响。1.材料与方法 :主要试剂有ＤＭＥＭ细胞培养液 ;胰蛋白酶 ;12 5Ｉ ＥＴ 1;抗α ａｃｔｉｎ单抗 ;小牛血清 ;ＥＴＡ ＯＤＮｓ和ＥＴＢ ＯＤＮｓ。实验方法 :(1)细胞培养 :无菌状态取 3只家兔主动脉段 ,按文献 [1]方法培养ＳＭＣ ,取 4～ 6代细胞…     

原位肝移植供肝切取与修整技术的探讨

我院自 1999年 7月～ 2 0 0 1年 10月为 2 8例患者施行了原位肝移植术。我们体会在肝移植术全过程中 ,供肝的切取、保存、修整技术对于移植术后移植肝的存活、功能的恢复及术中术后并发症的发生有至关重要的影响。现结合 2 8例原位肝移植术的供肝切取及修整技术报告如下。一、临床资料2 8例供体均为男性脑死亡患者 ,年龄 2 3～ 4 0岁 ,采用经腹主动脉灌注 0～4℃肾保存液 (高渗枸橼酸盐嘌呤液 ,上海市血液中心生产 ) 2 0 0 0ｍｌ,经门静脉灌注 0～ 4℃ＵＷ液 2 0 0 0ｍｌ,肝脏离体后继续灌注ＵＷ液 2 0 0 0ｍｌ的肝肾联合快速切取法。供肝的…     

小鼠白细胞介素-2基因修饰肝癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用

我们利用阳离子脂质体Ｔｒａｎｓｆｅｃ ｔａｍ将携带小鼠白细胞介素 (ｍＩＬ) 2基因的真核表达质粒导入小鼠肝癌细胞 ,经放射线照射后制成瘤苗 ,观察其对荷瘤小鼠的治疗作用。一、材料和方法1.主要试剂 :阳离子脂质体Ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔａｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ｍＩＬ 2采用酶联免疫吸附测定法 (ＥＬＩＳＡ法 )测定 ,检测试剂盒购自Ｅｎｄｏｇｉｎ公司。质粒携带ｍＩＬ 2基因的真核表达质粒(ＶＲ1110 ) [1] 由美国Ｖｉｃａｌ公司惠赠。2 .实验动物和细胞株 :雌性ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠 ,6～ 8周龄 ,购自上海医科大学实验动物中心。小鼠肝…     

生长激素对梗阻性黄疸时肿瘤坏死因子-α及内毒素血症的影响

我们通过建立梗阻性黄疸 (ＯＪ)大鼠动物模型 ,探讨重组人生长激素 (ｒｈＧＨ)对肿瘤坏死因子 α(ＴＮＦ α)的影响及机制。一、材料和方法成年雄性大鼠 60只 ,体重 2 90～ 350ｇ。随机分为假手术 (ＳＯ)组、ＯＪ组、ＯＪ +ｒｈＧＨ组 ,每组 2 0只。标准内毒素和鲎试剂检测盒购自广西医科大学生物制品有限公司。ＴＮＦ α酶联免疫吸附(ＥＬＩＳＡ )试剂盒购自法国ＢｅｓａｎｃｏｎＣｅｄｅｘ公司。ｒｈＧＨ为瑞士雪兰诺大药厂生产 ,商品名Ｓａｉｚｅｎ。法国Ｐ50 0紫外可见光分光光度仪 ,奥地利产ＨＴ3型酶标仪。动物模型建立 :ＳＯ组仅分离…     

供肝获取和灌洗方式对移植术后早期肝功能的影响

目的 探讨不同的供肝获取和灌洗方式对移植术后早期肝功能的影响.方法 对442例肝移植的临床资料进行回顾性分析.442例均为尸体供者,供肝切取术中采用腹主动脉和脾静脉插管对供肝进行原位灌洗,灌洗液为4℃UW液或4℃UW液联合高渗枸橼酸盐嘌呤溶液(HC-A液),获取的供肝均保存于UW液中.按照供肝获取方式、灌洗液的种类、灌洗液静脉引流途径及胆道冲洗方法的不同将病例分为5组.肝移植术后1周,测定受者血清总胆红素(TBil)、直接胆红素(DB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)及前白蛋白(PA)等肝功能指标,以及活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白(Fb)及国际标准化比值(INR)等凝血功能指标.结果 肝、肾分别切取者的供肝获取手术耗时(17.6±2.5)min,联合切取者为(15.9±2.3)min,二者间的差异有统计学意义(P＜0.05).联合切取者中,灌洗液经颈静脉引流者的γ-GT、AST、PT和INR明显低于经肝下下腔静脉引流者(前一项P＜0.01,后三项P＜0.05),而Fb明显高于经肝下下腔静脉引流者(P＜0.05);采用UW液和HC-A液联合灌洗者,其γ-GT、ALT、AST,DB和TT均明显低于单用UW液灌洗者(前三项P＜0.05,后二项P＜0.01),而Fb明显高于单用UW液灌洗者(P＜0.01).结论 联合切取法有利于缩短器官获取时问;采用UW液和HC-A液联合灌洗及灌洗液经颈静脉引流更有利于术后早期肝功能的恢复.     

胰肾联合移植中供体胰十二指肠及肾脏切取的体会

1999年 9月至 2 0 0 1年 6月间 ,我科共进行了 8例胰肾一期联合移植手术 ,均获得成功。现将供体胰十二指肠及肾脏的切取经验体会报告如下。资料与方法本组 8例供者均为男性 ,平均年龄为 (30± 6)岁 ,热缺血时间为 (2± 0 5)ｍｉｎ ,供体的切取时间为 (1 5± 3)ｍｉｎ ,灌洗液为ＵＷ液。供者为仰卧位 ,腰部垫高 ,取腹部正中大“十”字切口 ,开腹后立即倒入大量的无菌碎冰 ,迅速将小肠系膜向左侧腹拉起 ,以便显露腹主动脉。于腹主动脉分叉处上方切一小口 ,近端插入Ｆ1 8号带 3～ 4个侧孔的气囊导尿管 ,气囊内充 1 5～2 0ｍｌ生理盐水 ,在切口…     

经尿道前列腺汽化电切术灌洗液吸收量的临床观察

经尿道前列腺切除术中灌洗液吸收是发生电切综合征 (ＴＵＲＳ)的主要原因。我们对 62例经尿道前列腺汽化电切(ＴＵＶＰ)患者术中与灌洗液吸收有关的参数进行了测定。现报告如下。材料与方法　 62例中、重度良性前列腺增生患者 ,分为耻骨上前列腺切除(简称耻骨上组 )和ＴＵＶＰ组。耻骨上组 2 0例 ,平均年龄 72岁。尿潴留 7例 ,ＩＰＳＳ( 3 0± 5 )分 ,Ｑｍａｘ ( 6.7± 3 .0 )ｍｌ/ｓ,Ｂ超前列腺体积 ( 76.5± 3 4.5 )ｍｌ,剩余尿 ( 15 0± 65 )ｍｌ。ＴＵＶＰ组 42例 ,平均年龄 69岁。尿潴留 19例 ,ＩＰＳＳ( 2 9± 5 )分 ,Ｑｍａｘ( 7.6±…     

膀胱癌化疗中纤维连接蛋白介导的药物耐受研究

纤维连接蛋白 (ＦＮ)与肿瘤的浸润、生长、转移有密切的关系。Ｄａｍｉａｎｏ等[1]发现 ,多发性骨髓瘤细胞粘附于包被ＦＮ的培养板后 ,对化疗药物的敏感性降低 ,将其称为细胞粘附介导的药物耐受(ＣＡＭ ＤＲ)。我们的实验检测了膀胱肿瘤细胞与ＦＮ粘附后对化疗药物敏感性的变化。一、材料与方法1 实验材料 :膀胱癌细胞株Ｔ2 4购自中科院上海细胞所 ;ＭＴＴ、丝裂霉素Ｃ(ＭＭＣ)均购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ;ＦＮ与小牛血清 (ＢＳＡ)购自美国ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司 ;ＡＮＮＥＸＩＮⅤ试剂盒购自Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司。∑ 960型酶标仪、…     

包皮中单纯疱疹病毒Ⅱ型和人乳头瘤病毒的检测

单纯疱疹病毒 Ⅱ 型 (ｈｅｒｐｒｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ Ⅱ ,ＨＳＶ 2 )和人乳头瘤病毒 (ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ,ＨＰＶ)是重要的性传播病毒 ,近年来ＨＳＶ 2和ＨＰＶ在我国人群感染率日益增多[1] 。大量资料表明 ,宫颈癌及阴茎癌的发生与ＨＳＶ 2和ＨＰＶ感染关系密切[2～ 5] 。我们采用聚合酶链反应 (ＰＣＲ)检测了 4 8例包皮环切病人的包皮和其中 15例伴侣的宫颈脱落细胞中ＨＳＶ 2和ＨＰＶＤＮＡ序列 ,并讨论其临床意义。1　材料与方法1 1　标本　本校中南医院泌尿外科 1998年 4～ 8月 4 8例包皮环切病人 (包…     

肝干细胞研究方法进展

当前 ,国外有关肝干细胞 (又称肝祖细胞或肝干 /祖细胞 )研究进展迅速 ,但国内研究甚少 ,主要原因是方法学受限。肝干细胞方法学较为复杂 ,涉及其活化、分离培养、细胞特异性标志物筛选及细胞体内演变的鉴定等。现将有关研究方法进展综述如下。一、分离培养方法 (图 1 )肝干细胞的分离与培养是研究其生物学特性以及通过细胞移植治疗肝病的必要前提 ,因而倍受重视。Ｙａｓｕｉ等[1 ] 从ＬＥＣ(Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎ)大鼠分离肝脏细胞 ,继用胶原酶、蛋白酶Ｅ、胰蛋白酶及ＤＮＡ酶破坏大肝细胞 ,然后将细胞悬液覆盖于 1 .0 35～…     

不行体外静脉转流原位肝移植治疗肝豆状核变性一例

我院于 2 0 0 1年 9月为一名肝豆状核变性患者成功施行了不经体外静脉转流的经典式同种异体原位肝移植 ,目前患者存活 1 2个月。现报告如下。一、资料与方法1 .受者情况 :男性 ,2 0岁 ,体重 53ｋｇ ,临床诊断为肝豆状核变性 ,于 2 0 0 1年 9月 2 9日在全身麻醉下行原位肝移植术。术中见病肝呈重度结节样硬变 ,无腹水 ,血管无变异。2 .供肝切取 :供肝取自于一体重 50ｋｇ、2 2岁之男性尸体 ,与受者同为Ｂ型血。供肝切取采用快速多器官联合切取技术 ,肠系膜上静脉和腹主动脉插管 ,以ＵＷ液灌洗 ,灌洗液总量约为 2 0 0 0ｍｌ,离体后经门静脉灌…     

单纯酶与复合酶对成猪胰岛分离效果的研究

我们根据Ｍｅｙｅｒ等研究结果,参照Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ等的方法并加以改进,分别采用单纯酶与复合酶消化法分离成猪胰岛,并对两种方法做了比较,现将结果报道如下。一、材料与方法１．实验材料　（１）主要试剂：①胶原酶Ⅳ型（美国ｓｉｇｍａ公司生产）;②弹性蛋白酶（美国ｓｉｇｍａ公司生产）;③纤维素酶（美国ｍｅｒｃｋ公司生产）;④胶原酶Ⅰ型（美国ｓｉｇｍａ公司生产）。（２）胰腺切取：哈尔滨市哈达屠宰厂提供成年杂种活猪１６头,猪龄１２～２４个月。屠宰放血后在相对无菌情况下,仔细取出整个胰腺放在冷ＲＰＭＩ１６４０…     

联合应用UW液与乳酸林格氏液供肝灌注保存（附6例报告）

在人同种异体原位肝移植中 ,供肝的切取、灌注和保存是手术成功的关键之一 ,ＵＷ液是目前较佳的供肝保存液 ,已经实践证实和得到公认 ,可有效保存供肝 2 4小时以上 ,但其价格昂贵 ,使用受到许多限制。 1999年 10月至 2 0 0 0年 6月 ,我们联合应用ＵＷ液和乳酸林格氏液对 6例供肝进行低温重力灌注 ,然后应用ＵＷ液冷保存 ,保存最长时间为 12小时 ,术后肝脏功能恢复顺利 ,现报告如下。灌注前ＵＷ液及乳酸林格氏液冷却保存 ,温度保持在0℃～ 4℃ ;使用前ＵＷ液根据要求配给青霉素、地塞米松和胰岛素。 6例中ＵＷ液用量最多 1例为 6 0 0 0ｍｌ,…     

成人胰岛细胞的分离

目的　探讨成人胰岛细胞的分离及胰腺冷缺血时间与胰岛细胞活率的关系。方法　采取胰、肾联合切取 ,经腹主动脉插管 ,用自制的灌注器以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液 (HC A液 ) 15 0 0～2 0 0 0ml进行原位灌洗。将肾与胰腺、十二肠、脾分离 ,采用胶原酶P消化胰腺 ,分离并纯化胰岛细胞 ,以双硫腙及丫腚橙染色 ,测定所得到的胰岛细胞的纯度及活率。结果　胰腺的冷缺血时间为 2 .5～ 8h ,温缺血时间为 0～ 3min。胰岛收获量为 (2 .38± 0 .6 7)× 10 3 IEQ/g ,纯化后胰岛细胞的活率为 19%～ 83% ,冷保存指数 (或输注指数 )为 9.8～ 6 6 .4。胰岛细胞的活率与胰腺的冷缺血时间呈负相关 ,冷保存指数和胰岛细胞活率呈负相关。结论　以高渗枸橼酸盐嘌呤溶液灌洗、胶原酶P消化胰腺所得到的胰岛细胞活率高 ,但胰腺的冷缺血时间不宜超过 5h。     

三氧化二砷对肝癌细胞株BEL-7404、SMMC-7721 和肝癌裸鼠移植瘤模型的作用

砒霜主要成分为三氧化二砷(Ａｓ2 Ｏ3) ,用于治疗急性早幼粒细胞白血病效果良好 ,且毒副作用较低[1] 。本研究旨在观察Ａｓ2 Ｏ3对人肝癌细胞株ＢＥＬ 740 4,ＳＭＭＣ 772 1和肝癌裸鼠移植瘤模型的影响 ,探讨Ａｓ2 Ｏ3对原发性肝癌的作用及其机制 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.药物和试剂 :0 .1%Ａｓ2 Ｏ3溶液购自哈尔滨医科大学第一附属医院 ;噻唑蓝 (ＭＴＴ)购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ;细胞凋亡原位检测试剂盒为德国ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司产品。小鼠抗增殖细胞核抗原多克隆抗体为美国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司产…