PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用

目的 探讨运用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌快速鉴定方法的可行性。方法 选取肠杆菌科食源性感染14种常见致病菌的23SrRNA基因作为鉴别靶基因，采用通用引物PCR（UP-PCR）进行扩增，并对PCR产物的酶切片段进行限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）和单链构象多态性分析（SSCP）。结果 针对23SrRNA基因片段的Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出相似的RFLP图谱。SSCP分析显示，14种肠杆菌科常见致病菌SSCP图谱变异性很大，有利于进行细菌鉴定。结论 运用PCR-SSCP技术可进行肠杆菌科食源性感染致病菌的快速鉴定。     

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)鉴别乙型流行性感冒(流感)病毒的巴拿马株与维多利亚株,对乙型流感病毒血凝素(HA)基因采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示:乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,且与甲1与甲3型流感病毒无交叉反应.该片段经HindⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603bp与242bp的2个片段,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无HindⅢ酶切位点,仍呈872bp的一个片段.表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定,而且可快速敏感地从临床标本中直接对两类乙型流感毒株进行鉴别.     

贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎病毒分子生物学特征

目的研究贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎(脊灰)病毒分子生物学特征。方法对贵州省2004年分离到的所有脊灰病毒,用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行了型内鉴定,并对型内鉴定异常株进行了VP1区的序列测定。结果贵州省在2004年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及接触者、流动人口和健康儿童的粪便标本中,共有95例分离到脊灰病毒。其中Ⅰ型22例,Ⅱ型26例,Ⅲ型21例,混合型19例,脊灰病毒混合非脊灰肠道病毒7例。经用PCR-RFLP和ELISA方法进行型内鉴定,共有16株病毒与疫苗株病毒存在差异,其中3株脊灰病毒与疫苗株病毒在PCR-RFLP图谱上有差异[其中1株同时为双反应(DRV)],3株ELISA结果为DRV,11株ELISA结果为非疫苗类似株(NSL)。在这些型内鉴定异常株病毒中,Ⅰ型13株,Ⅱ型3株。对这16株脊灰病毒进行VP1区序列测定,发现9株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)和1株Ⅱ型VDPV。结论根据对贵州省2004年从95例AFP病例及接触者、流动人口、健康儿童分离的脊灰病毒的血清定型结果和型内鉴定结果及对13株Ⅰ型和8株Ⅱ型脊灰病毒VP1区核苷酸序列测定证实,脊灰减毒活疫苗病毒在人群的循环导致疫苗病毒神经毒力恢复突变。通过AFP病例监测系统及时发现了Ⅰ型VDPV的循环和Ⅱ型VDPV。对2004年下半年脊灰病毒基因特点的分析,提示贵州省已经阻断了Ⅰ型VDPV的循环。     

用PCR/RFLP技术对福建省宁化林区鼠蜱类中斑点热群立克次体的检测

目的 了解福建省宁化林区斑点热自然疫源地存在情况.方法 用聚合酶链反应(PCR)对该林区鼠、蜱类中感染斑点热群立克次体(SFGR)进行扩增.用限制性酶切片段长度多态分析(RFLP)法对分离株NH-97进行鉴定,并同已知的西伯利亚立克次体等国际标准株进行比较.结果 从越原血蜱、金泽革蜱、微小牛蜱中扩增出SFGR特异的DNA片段,NH-97分离株的PCR产物经PstI和RsaI酶切后发现它们的酶切图谱与西伯利亚立克次体246国际标准株相同.从社鼠,黄胸鼠脏器中扩增出康氏立克次体DNA片段.由不同来源批次的越原血蜱中扩增出近缘于日本立克体DNA片段和相关序列提示:可能是斑点热群立克次体新成员.结论 福建宁化林区除存在西伯利亚立克次体外,还可能存在康氏立克次体,日本立克次体等多种斑点热群立克次体的疫源地.     

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。     

杭州地区肥胖儿童的ApoE基因HhaI酶切位点多态性研究

相关研究表明,载脂蛋白E(ApoE)基因的多态性影响血脂水平,特别是血清胆固醇水平,与儿童高血脂、冠心病(coronary heart disease,CHD)等多种疾病有关[1].我们利用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对来我院就诊的杭州地区肥胖儿童的ApoE基因的多态性进行分析,并检测其血脂水平,以便找出其与儿童肥胖的关系.