人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞 …

目的 利用含有人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６全基因的质粒转染正常人角质形成细胞，观察ＨＰＶ１６ｍＲＮＡ在转染细胞的表达。方法 用ＦｕＧＥＮＥ＾ＴＭ６转染试剂，将携带ＨＰＶ１６全基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ／１６转染体外培养的正常人角质形成细胞，在转染后２４ｈ提取细胞总ＲＮＡ和ＤＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析，结果 ２４ｈ后，ＲＴ－ＰＣＲ成功地扩增出１１０ｂｐ的片段，转染细胞中已出现Ｈ     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

皮肤科学基础

20131668 PML基因诱导角质形成细胞凋亡及其Fas,Fasl和Bcl-2表达/王琼玉(西安交大医学院二附院皮肤科),马慧群,王世捷…//中国皮肤性病学杂志.-2013,27(6).-550~596通过流式细胞仪及AnnexinV法检测经PML基因转染的角质形成细胞凋亡;采用免疫组织化学、基因探针杂交测定经PML基因作用后的角质形成细胞Fas,Fasl和Bcl-2表达。结果:PML基因上调角质形成细胞Fas及Fasl表达(P<0.01),抑制Bcl-2基因表达,诱导     

小鼠角质形成细胞 MHC-Ⅰ类限制性内源性抗原递呈系统的构建

目的：建立一转染小鼠角质形成细胞系，使其表达MHC－Ⅰ类分子限制的卵白蛋白（ovalbumin,OVA）抗原。方法：将含有融合OVA基因（在角蛋白5的启动下）和小鼠H－2K^b的重组质粒转染于小鼠PAM212细胞（H－2K^d）。采用RT－RCP和流式细胞分析技术检测相应基因的转录及翻译水平的表达。结果：本实验建立了2个表达小鼠H－2K^b分子（命名为PAM－Kb）的转染细胞系，4个可表达OVA mRNA（命名为PAM－OVA）的转染细胞系和2个可同时表达小鼠H－2K^b分子和OVAmRNA的转染细胞系（命名为PAM－OK）。结论：所建立的MHC－Ⅰ限制的内源性抗原系统为进一步理解多肽／MHC－Ⅰ复合体与具有相应特异T细胞受体的CD8^ T细胞之间的相互作用奠定了基础。     

nicastrin基因沉默的HaCaT细胞基因表达谱分析

【摘要】 目的 通过沉默人永生化角质形成细胞HaCaT细胞中nicastrin（NCSTN）基因的表达,研究其下游细胞增殖及分化相关信号通路的改变。方法 将HaCaT细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组：干扰组转染特异性NCSTN-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组转染等量转染试剂。实时PCR及Western印迹检测各组NCSTN mRNA和蛋白表达验证转染效率。运用Agilent人类全基因组表达谱芯片技术研究干扰组HaCaT细胞基因表达谱与阴性对照组之间的差异,以表达上调或者下调倍数 ≥ 2.0且P ≤ 0.05为标准,将差异基因用GO分析进行富集,筛选出表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的基因,用实时PCR验证结果。结果 干扰组HaCaT细胞NCSTN mRNA及蛋白相对表达量分别为0.287 ± 0.090、0.443 ± 0.085,明显低于阴性对照组（0.969 ± 0.127、1.047 ± 0.114）以及空白对照组（1.000 ± 0.151、1.000 ± 0.111）,差异均有统计学意义（F值分别为30.787、31.139,P值均为0.001）。表达谱芯片显示,与阴性对照组相比,干扰组表达下调基因605条,上调基因444条。GO分析显示,干扰后差异表达基因富集到上皮发育、上皮细胞分化、角质形成细胞分化、角化4种生物学过程。对表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的Sprouty相关蛋白2基因、表皮生长因子7基因、胰岛素样生长因子结合蛋白5基因、人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2基因和骨形成发生蛋白6基因通过实时PCR验证,验证结果与芯片结果显示的差异趋势一致。结论 NCSTN基因功能缺失有可能通过调节其下游细胞增殖及分化相关信号通路的表达,影响角质形成细胞的正常增殖和分化。     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

靶向角蛋白17基因的小干涉RNA对角质形成细胞增生与凋亡的影响

目的利用RNA干涉技术诱导角蛋白17(K17)基因沉默,观察其对角质形成细胞(KC)增生和凋亡等生物学活性的影响。方法合成两条含有针对人K17mRNA序列的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体psilencer3.1-H1neo相连接,经鉴定后转染人角质形成细胞系HaCaT,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(W est-ern b lot)检测转染细胞K17 mRNA与蛋白水平的改变,用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期及凋亡情况,并通过透射电镜观察细胞的凋亡。结果成功构建了靶向人K17基因的siRNA表达载体psilencer3.1/K17,检测到瞬时转染的HaCaT细胞中K17的蛋白水平及mRNA水平均明显下降。流式细胞仪检测表明转染细胞的细胞周期发生了明显的G1期阻滞并证实凋亡的存在,电镜下观察到凋亡小体。结论对于增生活跃的角质形成细胞,K17的表达对其增生、分化和凋亡等生物学活性具有重要影响。靶向K17的siRNA能够抑制角质形成细胞增生,诱导其凋亡。     

反义蛋白激酶Cζ对角质形成细胞增殖的影响

目的 研究蛋白激酶C(PKC)ζ亚类在角质形成细胞增殖中的作用.方法 采用基因转染的方法将PKCζ基因导入角质形成细胞株Colo16中,初步研究了表达反义PKCζ对Colo16角质形成细胞增殖的影响.结果 表达反义PKCζ的角质形成细胞形态发生改变,生长速率明显减慢,被阻抑在G1期.结论 反义PKCζ抑制Colo16角质形成细胞的增殖.     

γ—干扰素诱导角质形成细胞凋亡及其Fas抗原表达研究

目的：探讨γ－干扰素在银屑病发病中的作用。方法 通过流式细胞仪测定角持形成细胞中亚二倍体细胞含量、片段化DNA分析及AnnexinV法检测经γ－干扰素诱导的角质形成细胞凋亡;采用组织化学、流式细胞仪测定经γ－干扰素作用后的角质形成细胞Fas抗原表达。结果 γ－干扰素上调角质形成细胞Fas抗原表达（P＜0．01）,诱导角质形成细胞凋亡（P＜0．01）。结论 γ－干扰素可能通过上调角质形成细胞Fas抗原表达,进而诱导角质形成细胞凋亡而参与银屑病发病。     

神经酰胺诱导培养角质形成细胞分化的实验研究

目的：观察神经酰胺对无血清培养角质形成细胞分化的影响。方法：选择两种神经酰胺（C2和C6）,分别添加于无血清培养的角质形成细胞液中,并在添加后0、3、6、12、24h分别回收总RNA,用逆转录PCR（RT－PCR）方法,检测角质形成细胞分化的特异性标记：TGase1、IVL、KRT、、KRT10等mRNA表达情况。结果：神经酰胺添加后,C2－神经酰胺对TGase1 mRNA、IVL mRNA表达在12小时均明显上升,在24小时分别升高达阴性对照的5.7倍和5.2倍;但C2－神经酰胺对KRT1 mRNA和KRT10 mRNA表达升高不明显。C6－神经酰胺对TGase1 mRNA、IVL mRNA表达大致与C2－神经酰胺相似,只是24小时表达比C2－神经酰胺降低,分别为阴性对照的3.3倍和3.5倍;但C6－神经酰胺对KRT1 mRNA和KRT10 mRNA表达显著高于C2－神经酰胺,24小时分别高达5.4倍和10倍。结论：神经酰胺能明显升高无血清培养的角质形成细胞对分化特异性标记蛋白mRNA的表达,诱导角质形成细胞的分化。     

银屑病患者角质形成细胞对朗格汉斯细胞免疫刺激功能的影响

为探讨银屑病患者皮损处角质形成细胞对朗格汉斯细胞（LCs）免疫刺激功能的影响，从健康者外周血分离单核细胞，经IL－4＋GM－CSF＋TGF－β1培养5天后分化发育为1Cs,再加入银屑病患者角质形成细胞培养上清继续培养2天，然后通过Leica显微镜观察其形态；通过混合淋巴细胞反应分析其种T的刺激功能。结果显示，以健康人角质形成细胞上清为对照，LCs经银屑病患者角质形成细胞上清培养2天后，拥有不规则突起的细胞明显较正常组增多。同时，其刺激T淋巴细胞增殖的能力也增强。结果表明，银屑病患者角质形成细胞上清培养的LCs表现出较强的免疫刺激功能，并在银屑病相关的免疫反应过程中发挥了重要作用，提示这可能与银屑病患者角质形成细胞表达的某些因子有关。     

绿色荧光蛋白基因转染角质形成细胞的瞬时表达检测

近来的研究已发现皮肤角质形成细胞具有许多功能和活性,它不仅符合基因治疗中靶细胞的基本条件,而且还具有许多优点,如取材方便、易于回植、便于观察和调控基因表达情况及副作用,因而,角质形成细胞被认为是一种理想的靶细胞。为了证实角质形成细胞作为基因转染、基因表达及基因治疗中靶细胞的可行性,本实验将ｐＥＧＦＰＮ３质粒转染皮肤角质形成细胞,并对其瞬时表达情况进行了检测。一、材料和方法（一）实验材料:质粒:ｐＥＧＦＰＮ３质粒由本校病理学教研室赵利军博士惠赠（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｎｅｓ，Ｉｎｃ产品）,该质粒在…     

复方甘草酸苷对体外培养的角质形成细胞的作用

目的观察复方甘草酸苷(CG)对角质形成细胞表达CXCR2及分泌TGF-β1的影响。方法不同浓度CG处理人角质形成细胞株HaCat,MTT法检测CG对HaCat的增殖抑制作用,流式细胞仪分析CG处理后的HaCat细胞的CXCR2表达。培养正常人表皮角质形成细胞,观察CG处理后,培养液中TGF-β1含量的变化。结果50~200μl/m l的CG抑制HaCat细胞的增殖,干预24 h即可见到明显的抑制作用,CXCR2的表达明显低于正常对照组。正常原代角质形成细胞的培养上清中TGF-β1分泌增加。结论50~200μl/m l CG促进素角质形成细胞表达CXCR2和TGF-β1分泌,抑制角质形成细胞的增殖。     

蛋白激酶C抑制剂GF109203X诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞的初步研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞的可能性。方法采用酶消化法结合Ⅳ型胶原快速贴壁法获得人原代表皮干细胞及角质形成细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,免疫细胞化学染色法检测GF109203X诱导培养后角质形成细胞的表型及功能改变。同期分离培养的人在体表皮干细胞作为本次实验的阳性对照,原代角质形成细胞培养2 d后加等体积二甲基亚砜为阴性对照。结果表皮干细胞快速黏附,培养4 d后细胞呈圆形,形态规则,折光性强,明显克隆,β1整合素、CK19及CK14呈阳性表达,CK10阴性表达;已分化角质形成细胞不能快速黏附,培养4 d细胞呈类圆形,大小不一,折光性较差,无明显克隆,β1整合素、CK19及CK14呈阴性表达,CK10呈阳性表达。角质形成细胞经GF109203X诱导培养2 d后,实验组与阳性对照组细胞群β1整合素、CK19、CK14均呈阳性表达,但实验组较阳性对照组中细胞β1整合素、CK19、CK14阳性细胞数少,CK10均呈阴性表达;阴性对照组中细胞群β1整合素、CK19及CKl4呈阴性表达,CKl0呈阳性表达。结论 GF109203X能够诱导角质形成细胞去分化形成表皮干细胞。     

白念珠菌对角质形成细胞β防御素-2 mRNA表达的影响

目的 探讨白念珠菌及其菌体成分对人角质形成细胞β防御素-2表达的影响。方法 采用酶解、反复冻融、超声破碎和超速离心等方法制备真菌成分;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测白念珠菌及其菌体成分刺激人角质形成细胞24h后β防御素-2mRNA表达。结果 正常培养的人角质形成细胞和角质形成细胞永生细胞系HaCaT均有β防御素-2mRNA的少量表达,白念珠菌、白念珠菌细胞壁提取物和纯甘露聚糖可以使β防御素-2mRNA表达增强(P值分别<0.01、0.05和0.01),而白念珠菌培养上清液和细胞浆提取物对β防御素-2表达无明显影响(P>0.05)。结论 白念珠菌可上调角质形成细胞β防御素-2mRNA的表达,甘露聚糖可能是起诱导作用的活性成分。角质形成细胞通过表达β防御素-2在皮肤黏膜的抗感染防御机制中发挥重要作用。     

慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.     

白介素8及其受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达

目的 观察白介素8（IL－8）及基受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达及在银屑病的临床及病理表现中的作用。方法 培养银屑病患者皮损处角质形成细胞，通过微孔小室实验检测其上清液的趋化功能，通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL－8的表达，通过流式细胞仪分析银屑病患者皮损处角质形成细胞的趋化因子受体CXCR2的表达。结果 银屑病患者皮损处角质形成细胞分泌上清液对中性粒细胞的趋化能力明显强于正常对照组，其分泌的IL－8水平也高于正常人，皮损处角质形成细胞CXCR2的表达也明显强于正常对照组。结论 银屑病患者皮损局部表面出的角质形成细胞高度增殖与角质形成细胞高分泌、高表达具有促增殖作用的IL－8及其受体CXCR2有关，同时皮损局部大量的炎性细胞的浸润部分可能是由于角质形成细胞高分泌具有趋化能力的IL－8，它们可能在银屑病的发生、发展中起着重要作用。     

γ—干扰素诱导角质形成细胞凋亡及其Fas抗原表达研究

目的：探讨γ－干扰素在银屑病发病中的作用。方法：流式细胞仪测定亚二倍体含量、片段化DNA分析、Annexin V凋亡检测法、免疫组织化学、间接免疫荧光流式细胞仪测定Fas抗原表达。结果：γ－干扰素上调角质形成细胞Fas抗原表达（P＜0．01）,诱导角质形成细胞凋亡（P＜0．01）,结论：γ－干扰素可能通过上调角质形成细胞Fas抗原表达,进而诱导角质形成细胞凋亡而参与银屑病发病。     

血管生成素对人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖的影响

目的:探讨血管生成素对体外培养的人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖的影响.方法:采用两步酶消化法分离和培养人毛囊外毛根鞘角质形成细胞,将与绿色荧光蛋白基因共表达的血管生成素真核表达质粒pEGFP-ANG转染人毛囊外毛根鞘角质形成细胞,同时设立转染空质粒的pEGFP-C2组和只加转染液的阴性对照组,48 h后利用ELISA法检测细胞上清液中血管生成素的表达,同时四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.另外,将不同浓度的重组人血管生成素(0～200μg/L)加入人毛囊外毛根鞘角质形成细胞中,培养48 h后MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期.结果:成功分离与培养了人毛囊外毛根鞘角质形成细胞,转染人血管生成素的细胞上清液中血管生成素的浓度明显高于转染pEGFP-C2组和阴性对照组(P＜0.001),且其能够明显促进人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖(P＜0.001).另外,3.125～200.000 μg/L重组人血管生成素能够明显促进人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖(P＜0.001),其中以12.500 μg/L浓度组作用最为显著.流式细胞仪检测结果表明12.500～200.000 μg/L重组人血管生成素能够显著增加细胞增殖指数(P<0.05).结论:内源性和外源性血管生成素均能明显促进体外培养的人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖,提示血管生成素可能通过促进毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖而促进毛发生长.     

尖锐湿疣皮损角质形成细胞中β-catenin的表达

目的探讨β-catenin与尖锐湿疣皮损角质形成细胞增生的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法检测尖锐湿疣皮损感染的HPV分型,将HPV16/18型皮损分为高危型组(CA1),HPV6/11型皮损分为低危型组(CA2),每组30例;分别应用免疫组织化学及逆转录聚合酶链(RT-PCR)方法检测β-catenin蛋白及β-catenin mRNA在CA1组和CA2组角质形成细胞中的表达。结果在正常皮肤组织中β-catenin蛋白阳性物质均表达于胞膜;CA1组和CA2组中主要表达于胞核和胞质,CA1组和CA2组角质形成细胞中β-catenin蛋白均呈异常表达,异常表达率(分别为86.70%,40.00%)均显著高于正常对照组(0);CA1组和CA2组角质形成细胞中β-catenin mRNA的表达水平(阳性分别为23例,18例)亦均显著高于正常对照组(阳性10例)。结论尖锐湿疣皮损角质形成细胞中β-catenin表达异常,在胞膜、胞浆及胞核的分布与正常角质形成细胞不同,可能与细胞过度增殖有关。