痩素在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化早期的作用研究

目的 研究小鼠骨髓基质干细胞体外增生及向成骨细胞定向分化早期瘦素(Leptin)的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，在传代细胞培养时加入Leptln(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，分别检测两组的细胞增生情况。半定量RT-PCR方法检测成骨细胞相关基因Cbfal和Cbtb等在两组细胞分化过程中的表达。结果 实验组在细胞培养24和48h细胞数量明显少于对照组，显示时间与Leptin剂量依赖特性。Leptln在传代细胞培养中促进成骨细胞特异性转录因子Cbfal和Cbtb的表达。结论 Leptin抑制骨髓基质干细胞体外增生并促进早期成骨细胞相关基因的表达。     

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的 探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。方法 取4－6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3ml,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10^10、10^-9、10^-8、10^-7和10^-6mol/L的培养基,作用2、4、及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。结果 地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10^-8mol/L后抑制作用越显著。地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10^-8mol/L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2－4倍。结论 地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化成骨细胞, 浓度为10^-8mol/L较合适。     

地塞米松在人骨髓基质细胞诱导成骨细胞中的作用

目的 通过对人骨髓基质细胞体外培养及检测，研究地塞米松在骨髓基质细胞体外增生并向成骨细胞定向分化过程中的应用。方 法骨折内固定术扩髓前收集髓腔内骨髓进行原代和传代培养，传代后改用条件培养基（含地塞米松）和基础培养基（不含地塞米松）分别进行培养，应用组织化学及von Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶和细胞外基质矿化程度；半定量RT-PCR方法检测Cbfal mRNA和Osterix mRNA在细胞培养过程中不同时间点的表达。并观测地塞米松对上述成骨细胞相关基因表达的影响。结果 条件培养基组细胞Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达峰值高于基础培养基组细胞，并且峰值出现的时间提前。结论 地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响

目的 从细胞和基因水平探讨辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响.方法 18月龄雄性SD大鼠的骨髓基质干细胞进行成骨和成脂诱导培养,培养介质中加入辛伐他汀(10-6、10-7、10-8 mol/L和10-9 mol/L),同时设溶剂对照组.成骨检测:碱性磷酸酶(ALP)染色和定量,茜素红矿化染色和定量,ALP和骨钙素(OC)基因分析;成脂检测:油红脂肪细胞染色和定量,脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(PPARγ2) 基因分析.结果 在含有低剂量地塞米松的成骨诱导条件下,辛伐他汀随浓度增加促进了细胞基质的矿化,增强了ALP的活性及染色,提高了ALP和OC的基因表达(若无地塞米松,辛伐他汀则无法单独诱导成骨,此结果 未展示);同时,辛伐他汀随浓度增加减弱了脂肪细胞的油红染色,抑制了LPL 和PPARγ2的基因表达.显著性差异皆发生于10-6 mol/L和10-7 mol/L辛伐他汀组.结论 辛伐他汀随浓度增加抑制了老年骨髓基质干细胞的成脂分化,并中等强度地促进了老年骨髓基质干细胞的成骨分化.这表明辛伐他汀具有促进骨合成代谢的作用,可以用于治疗常见的骨代谢疾病,如增龄性的骨质疏松症.     

骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcellsBMSCs) ,又称骨髓间充质干细胞 ,是存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞。自 1968年Friendenstein利用BMSCs的粘附性特点 ,对其进行分离、培养 ,及多分化潜能研究以来〔1〕,BMSCs成为现代生物学和医学领域研究的热点。现普遍认为BMSCs是中胚层发育的早期细胞 ,具有多向分化潜能 ,不仅能分化为造血实质 ,支持造血 ,还可分化为多种造血以外的组织细胞 ,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、肝…     

成骨细胞与诱导剂对骨髓基质干细胞的增殖与成骨分化的影响

目的探索一种新的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)增殖与成骨分化的体外诱导培养体系. 方法乳大鼠颅骨来源的第3代成骨细胞与诱导剂(1 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸)对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响.于8块24孔板上培养MSCs,每孔接种5×104个第3代MSCs.按培养成分不同分为4组,每组2块.DMEM培养为对照组;诱导剂培养为诱导剂组;成骨细胞培养为成骨细胞组;联合使用成骨细胞与诱导剂培养为联合诱导组.计数诱导1～8 d各组MSCs的数量并绘制细胞生长曲线,检测诱导10 d的MSCs的碱性磷酸酶活性,采用RT PCR检测诱导2周时MSCs骨钙素mRNA的表达水平.结果原代及传代MSCs形态正常.细胞生长曲线示MSCs数量均随时间延长增加.成骨细胞组增殖最快,诱导剂组增殖最慢,5～8 d成骨细胞组及诱导剂组细胞数量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).联合诱导组碱性磷酸酶活性为2.01±0.56 U与对照组0.68±0.14 U、诱导剂组1.27±0.43 U及成骨细胞组0.77±0.19 U比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组不表达骨钙素mRNA,诱导剂组为0.783±0.094、联合诱导组为0.814±0.071与成骨细胞组0.302±0.026比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论联合使用成骨细胞和诱导剂诱导MSCs,不影响MSCs的正常增殖而促进MSCs的成骨分化,诱导效果较好,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系.     

不同荧光蛋白标记技术对兔骨髓基质干细胞体外增殖的影响

目的探讨不同荧光蛋白标记方法对兔骨髓基质干细胞体外增殖能力的影响。方法从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分别采用逆转录病毒和质粒转染两种方式进行增强型绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记,G418筛选培养3周后,测定细胞生长曲线和贴壁率的变化。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1、真核表达载体pDsRed2-C1均可以成功标记骨髓基质干细胞,G418筛选培养后,细胞表达明显的荧光蛋白,其阳性率增加。pLEGFP-N1标记组细胞倍增时间为(34.9±1.2)h,pDsRed2-C1组为(36.1±1.4)h,未标记组为(33.8±0.5)h,3组数据间无统计学差异(P>0.05)。结论荧光蛋白标记对骨髓基质干细胞体外增殖无明显影响,合理应用不同荧光蛋白及其表达载体将成为深入研究组织工程种子细胞的有力工具。     

地塞米松与TGFβ1对骨髓基质细胞增殖、分化及代谢的影响

目的　明确地塞米松与转化生长因子 β1对骨髓基质细胞增殖代谢及向软骨细胞分化的影响 ,为应用骨髓基质细胞构建组织工程化软骨提供技术参数。方法　抽取猪股骨骨髓 ,分离有核细胞 ,体外培养扩增并分别加入地塞米松 (40ng/ml)或地塞米松 (40ng/ml)与转化生长因子β1(10ng/ml)联合诱导。通过细胞计数及MTT法检测不同诱导因子对骨髓基质细胞增殖的影响 ,透射电镜观察不同诱导组细胞代谢功能的变化 ,免疫组化、原位杂交、RT -PCR及Northernblott等检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量的差异。结果　加入地塞米松后细胞增殖能力受到轻度抑制 ,而同时加入地塞米松与转化生长因子 β1后 ,细胞生长明显受抑制。电镜下可见随诱导因子的增加 ,细胞变得肥大 ,细胞器丰富 ,功能活跃。Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达在联合诱导组明显增强 ,且随诱导时间的延长 ,Ⅱ型胶原mRNA表达量也显著增加 (P <0 .0 1)。结论　地塞米松与转化生长因子β1能有效地诱导骨髓基质细胞表达软骨细胞特征性蛋白 ,但对细胞的增殖及代谢也产生明显的影响 ,在骨髓基质细胞构建组织工程化软骨时 ,应充分调整好诱导与增殖的关系     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

改良法体外诱导骨髓基质干细胞分化为类许旺细胞

目的　探讨一种较为有效的诱导方法将骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为类许旺细胞。　方法　用Dezawa所述方法 (称为传统诱导法 )加以改良成将所有诱导剂一起联合半量间隔诱导两次的方法 (称为改良诱导法 ) ,诱导后的细胞从形态学、抗S 10 0和抗GFAP细胞免疫化学染色的阳性率、MTT细胞活性测定及流式细胞仪检测细胞DNA含量来比较此两种方法对细胞的综合作用。　结果　改良法诱导的细胞在形态上更具有许旺细胞的长梭形外观 ,抗S 10 0及抗 GFAP阳性率分别由5 8 1%和 60 3 %提高到 79 4%、81 2 % (P <0 0 5 ) ;MTT法细胞活性测定表明改良法对细胞活性影响小(P <0 0 1) ;流式细胞仪DNA含量测定显示S期DNA含量较高 (P <0 0 5 )。　结论　改良法体外诱导骨髓基质干细胞为类许旺细胞具有诱导效果更好 ,对细胞损害小的优越性。     

辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用

目的 通过对小鼠骨髓干细胞体外培养的观察，研究辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞定向分化过程中的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，应用组织化学及yon Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶染色和细胞外基质矿化；在细胞培养早期加入辛伐他汀(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，应用半定量RT-PCR方法分别检测两组Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)、转录因子CBFA1和Osterix(OSX)在成骨细胞分化过程中的表达。结果 小鼠骨髓基质细胞经体外诱导后分化为具备碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质的成熟成骨细胞。实验组COL1、ALP和CBFA1表达在细胞培养第3，5天均高于对照组，OSX表达差异不明显。结论 辛伐他汀在成骨细胞分化过程中促进其相关基因的表达。     

小鼠骨髓干细胞向肝细胞转化的体外实验研究

目的建立以30 ng/ml FGF-4和30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,研究体外骨髓干细胞向肝细胞的转化过程中细胞形态、结构、功能的变化.方法建立以30ng/ml FGF,30ng/mlOSM为主的小鼠骨髓干细胞诱导培养体系.观察细胞形态和数量的变化;RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测肝细胞特异性标记物的表达;通过PAS糖原染色、白蛋白ELISA、尿素合成试验,检测细胞的合成和代谢功能.结果诱导12 d,观察到多极性的肝细胞样细胞,且逐渐增多、集落不断增大.在诱导过程中,不同的时间点可以分别检测到HNF-3βmRNA、ALBmRNA、CK18mRNA、TTRmRNA、G6-PasemRNA和TATmRNA的表达.诱导21 d,细胞表达HNF-3β、ALB、CK18蛋白;免疫荧光定位示ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆.诱导21 d,细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒;在诱导过程中,不同的时间点检测到细胞分泌ALB、合成尿素的量的变化.结论我们建立的以30ng/ml FGF、30 ng/ml OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓干细胞体外定向转化为肝细胞.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

Differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells into Schwann-like cells in vitro

Bonemarrowmesenchymalstemcells, alsocalledbonemarrowstromalcells (BMSCs), areisolatedfrombonemarrow, andtheycanmultiplyinvitroanddifferentiateintoosteogeniccells,chondrocytes, adipocytes, musclecellsandneuralcells.1 5 RecentstudieshavedemonstratedthatBMSCsfromadultratscoulddifferentiateintoSchwann likecellsinspecificconditions.6, 7 BMSCsmayhavepotentialapplicationforautologousneuraltransplantation. Inthisstudy, wetrytoinvestigatethedifferentiativecapabilityofadulthumanBMSCsintoSchwann l…     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

低氧处理对不同年龄C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的：：探讨低氧处理对不同年龄 C57小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。方法：全骨髓法从3~6周年轻C57小鼠(年轻组)股骨和胫骨的骨髓中提取、分离 BMSCs,传代至第6代,部分于37℃、5%CO2条件下中常规培养,连续5 d观察细胞的形态及数目,绘制细胞生长曲线;部分细胞进行成骨和成脂诱导。另取第6代BMSCs,随机分为低氧处理组(37℃、5%O2条件下培养30 min,再常规培养)和阴性对照组(不行低氧处理,仅常规培养),常规培养8h后固定细胞,结晶紫染色。观察两组细胞处理前后的数量变化。全骨髓法提取18~24个月老龄C57小鼠(老龄组)的骨髓细胞常规培养,连续12 d 观察细胞的形态及数目并绘制细胞生长曲线。将老龄组C57小鼠的骨髓贴壁细胞分为低氧处理组和阴性对照组,处理方法同年轻小鼠低氧处理和阴性对照组,于常规培养24 h后固定细胞,结晶紫染色,观察两组细胞处理前后的数量变化。结果：年轻 C57小鼠 BM-SCs 增殖能力强,可传代至第6代,经过5 d的培养细胞数量逐渐增加,并具有成骨、成脂诱导分化能力;但经低氧处理后,BMSCs呈片状脱落。老龄C57小鼠的骨髓贴壁细胞增殖能力差,经过12 d 的原代培养,细胞数量逐渐减少,并且只有一个集落形成;经低氧处理,贴壁细胞数量锐减,无新的集落形成。结论：低氧处理不能在体外扩增阶段提高C57小鼠BMSCs的增殖能力。     

辛伐他汀促进大鼠骨髓基质细胞的成骨分化

目的观察辛伐他汀体内给药对去卵巢大鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖和分化的影响,探讨辛伐他汀的成骨作用机制.方法24只12周龄雌性SD大鼠随机分成4组,每组6只假手术组(G1)和去卵巢组(G2)每天蒸馏水灌胃;去卵巢大鼠10mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃(G3);去卵巢大鼠20mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃(G4).实验持续4周,第29天处死所有大鼠取骨髓细胞培养.用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测成骨细胞的增殖能力;细胞培养第14天用半定量RT-PCR和western blot检测Runx2/Cbfal mRNA和蛋白的表达、第16天检测碱性磷酸酶活性(ALP)和第21天检测茜素红染色.结果辛伐他汀不能促进去卵巢大鼠成骨细胞增殖.G3组和G4组的Runx 2/Cbfa1 mRNA表达水平和ALP活性都显著高于G2组,给药两组之间无显著差别.G4组的Runx 2/Cbfal蛋白表达水平比G2组和G3组显著增加,G2组与G3组无明显差别.茜素红染色表明辛伐他汀能促进成骨细胞的矿化能力,两种剂量组之间无明显差别.结论辛伐他汀体内给药能够促进去卵巢大鼠BMSC向成骨细胞分化,但是不能促进细胞增殖.     

大鼠损伤脊髓提取液对骨髓基质细胞培养特性的影响

目的：探讨损伤脊髓提取液对骨髓基质细胞增殖和分化的影响。方法：将正常、伤后1周及伤后6周脊髓提取液加入细胞培养基中，以四唑盐法及免疫组化方法观察其对骨髓基质细胞增殖及抗原表达的影响。结果：加入脊髓提取液后对骨髓基质细胞的增殖无明显影响，但抗原表达发生变化，纤维连接蛋白(FN)表达减弱，且出现神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达，细胞形态出现神经细胞样改变。结论：骨髓基质细胞可能是一种脊髓损伤修复的理想细胞。     

肝细胞极化标志分子在骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中的表达

目的观察在体外诱导成人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞极化标志分子的表达和分布。方法从成人骨髓中分离基质干细胞，在体外诱导分化为成熟肝细胞。应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法比较肝细胞极化标志蛋白二肽酰基肽酶Ⅳ（DPPIV）和低密度脂蛋白受体（LDLr）mRNA在诱导分化（实验组）和非诱导分化（对照组）条件下的表达情况。应用免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察DPPIV和LDLr在细胞膜上的分布情况。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导后分化表达白蛋白，实验组DPPIV和LDLr mRNA的表达高于对照组（P〈0．05）。DPPIV和LDLr在肝细胞膜上呈特征性分布。结论成人骨髓基质干细胞在向肝细胞分化过程中表达肝细胞极化标志分子，进一步表明骨髓基质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。同时，肝细胞体外分化可以做为研究肝细胞极化形成机制的良好模型。