EGFR在高糖诱导下人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的观察EGFR信号通路对高糖诱导下人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响和机制。方法体外培养HK-2细胞,将细胞分为4组:对照组、渗透压对照组、高糖组和高糖加EGFR抑制剂AG1478组。用Western blot检测p-EGFR、total EGFR、cleaved caspase-3、BAX、BCL-2及β-actin的蛋白表达,四唑盐比色法(MTT)检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组和渗透压对照组相比,高糖组HK-2细胞EGFR活性、cleaved caspase-3表达、BAX/BCL-2比值和内质网应激(ERS)明显升高,细胞活性降低(P0.01)。EGFR抑制剂AG1478能够明显抑制高糖诱导的HK-2细胞EGFR活化和细胞凋亡(P0.05),提高细胞活性(P0.05),同时抑制内质网应激(P0.05)。结论抑制EGFR活性能够减少高糖诱导的HK-2细胞凋亡,这可能是通过减少内质网应激实现的。     

沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡

目的探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡的作用及其机制。方法用60 mg/L的ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化,记为ox-LDL组,不添加ox-LDL的作为对照(NC)组;将si-con和si-CXCL12转染至RAW264.7细胞中再用60 mg/L的ox-LDL处理,分别记为ox-LDL+si-con组、ox-LDL+si-CXCL12组。油红O染色法检测细胞泡沫化; Western blot检测ABCA-1、SRB-1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、CXCL12、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达;流式细胞计量术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测CXCL12 mRNA表达。结果 ox-LDL处理的RAW264.7细胞体积增大,形状变为圆形,胞质中可明显见到大量红色脂滴;ABCA-1和SRB-1表达水平显著升高(P0.05),cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),CXCL12表达水平显著升高(P0.05),p-p38MAPK表达水平显著升高(P0.05)。沉默CXCL12,大部分细胞内未见红染脂滴,仅少数细胞内有部分脂滴,ABCA-1和SRB-1表达水平显著降低(P0.05),cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达水平显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05),p-p38MAPK表达水平显著降低(P0.05)。结论沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化和细胞凋亡,其可能与p38MAPK信号通路有关。     

特异性小干扰RNA沉默CHOP对肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:研究C/EBP同源蛋白(CHOP)对肾小管上皮HK2细胞凋亡的影响。方法:采用qPCR法检测急性肾损伤患者及健康对照者血清中CHOP的mRNA水平。体外培养肾小管上皮HK2细胞,随机分为对照组、阴性组和si-CHOP组,si-CHOP组和阴性组分别转染CHOP小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,通过转化生长因子β1(TGF-β1)诱导细胞损伤。MTT法检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率, Western blot检测细胞中细胞核抗原Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与健康对照者相比,急性肾损伤患者血清中CHOP的表达量显著增加(P0.05);转染CHOP siRNA显著降低肾小管上皮细胞HK2中CHOP的水平,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。敲减CHOP的表达显著增加肾小管上皮HK2细胞的活力(P0.05),降低其凋亡率(P0.05),增加Ki-67和PCNA的表达量(P0.05),下调cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05)。结论:在急性肾损伤患者血清中CHOP的水平增加。敲减CHOP表达通过调节增殖和凋亡相关蛋白的表达抑制肾小管上皮HK2细胞的凋亡。     

TPX2通过p38 MAPK信号通路诱导直肠癌HR-8348细胞凋亡

目的:研究下调非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)对直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:用TPX2小干扰RNA(si RNA)转染直肠癌HR-8348细胞,记为TPX2 si RNA组;以不做转染的细胞作为正常对照(control)组;以转染si RNA阴性对照(si RNA-NC)的细胞作为si RNA-NC组;用p38 MAPK抑制剂处理敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞记为TPX2 si RNA+SB203580组。RT-qPCR和Western blot测定TPX2的表达水平,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平。结果:TPX2 si RNA转染后HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P 0. 05),而转染si RNA-NC对HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白水平没有影响。敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞存活率降低,凋亡率升高,细胞中的cleaved caspase-3、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显升高,Bcl-2水平水平降低,与control组比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。与TPX2 si RNA组相比,TPX2 si RNA+SB203580组的HR-8348细胞凋亡率、cleaved caspase-3水平和p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显降低,存活率明显升高(P 0. 05)。结论:TPX2表达下调可以通过激活p38 MAPK促进直肠癌HR-8348细胞凋亡。     

抑制蛋白激酶D1表达水平对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响及作用机制

目的:探讨下调蛋白激酶D1(PKD1)对高糖环境下心肌细胞凋亡的影响及机制。方法:实验分5组:Control组(正常培养的H9c2细胞)、HG组(H9c2细胞高糖条件培养24h)、si-NC组(H9c2细胞转染siRNA control后高糖条件培养24h)、si-PKD1组(H9c2细胞转染PKD1siRNA后高糖条件培养24h)和si-PKD1+SB203580组[H9c2细胞转染PKD1siRNA 12h后加入p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路抑制剂SB203580,再高糖条件培养24h],用qRT-PCR和Western blot方法检测各组细胞PKD1 mRNA和蛋白表达水平(si-PKD1+SB203580组除外);流式细胞术测定细胞凋亡情况,Western blot测定细胞促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平,同时检测细胞中p38MAPK及其磷酸化p-p38MAPK水平。结果:HG组细胞PKD1mRNA和蛋白水平均明显高于Control组(P0.01)。与HG组比较,si-PKD1组细胞中PKD1 mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达水平下降,细胞中p-p38MAPK水平降低(P0.01)。与si-PKD1组比较,siPKD1+SB203580组心肌细胞凋亡率进一步降低,细胞中Bax蛋白水平下降,p-p38MAPK、p-p38MAPK/p38MAPK水平降低(P0.01)。结论:高糖诱导心肌细胞PKD1表达,下调PKD1可能通过抑制p38MAPK信号通路激活减少高糖诱导的心肌细胞凋亡。     

p38 MAPK在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨p38 MAPK在顺铂诱导大鼠近端肾小管上皮细胞(RPTC)凋亡中的作用。方法:首先采用Western blot实验检测0、5、10和20μmol/L顺铂处理24 h对细胞凋亡的影响,确定最佳处理剂量;而后采用20μmol/L顺铂联合50 mg/L p38 MAPK抑制剂SB203580刺激RPTC,实验分为对照组、顺铂组及顺铂+SB203580(加入SB203580处理RPTC 1 h后再给予顺铂处理24 h)。采用相差荧光显微镜观察和流式细胞术分析顺铂处理后RPTC的凋亡情况;采用Ac-DEVD-AFC试剂盒检测RPTC裂解液中的caspase活性;Western blot实验检测p38、磷酸化p38、cleaved PARP和cleaved caspase-3等的蛋白水平;pH计检测顺铂处理后RPTC外环境pH值改变。结果:20μmol/L顺铂处理RPTC 24 h,可以明显诱导细胞凋亡;顺铂处理15 min后RPTC中p38 MAPK开始磷酸化并达到高峰。顺铂处理后12.08%的RPTC呈凋亡形态,具有增强的caspase活性,并且cleaved PARP和cleaved caspase-3水平明显升高(P0.05);p38 MAPK抑制剂SB203580可抑制p38的磷酸化,降低RPTC的凋亡率和caspase活性,并减少cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平。同时,SB203580可逆转顺铂诱导的RPTC培养基pH值的改变。结论:p38 MAPK的磷酸化在顺铂诱导的RPTC凋亡中发挥作用。顺铂诱导RPTC凋亡后,可改变细胞外酸性环境,并可被p38 MAPK抑制剂SB203580所抑制。     

干扰维生素D3上调蛋白1通过调控Shh影响高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制。方法:人近端肾小管上皮HK-2细胞用高糖处理后,real-time PCR和Western blot检测细胞中VDUP-1的水平。HK-2细胞转染VDUP-1小干扰RNA,real-time PCR和Western blot检测抑制效果。高糖条件培养VDUP-1表达下调的HK-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western blot检测细胞中音猬因子(Shh)信号通路关键蛋白Patched 1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)、锌指蛋白Gli2和Shh的水平。用外源性Shh处理HK-2细胞,Western blot检测Ptch1、Smo和Gli2的水平。用外源性Shh处理VDUP-1表达下调的HK-2细胞,高糖处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养液上清中TNF-α含量。结果:高糖处理后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平升高(P 0. 05)。转染VDUP-1小干扰RNA后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平下降(P 0. 05)。与正常培养的细胞相比,高糖处理后HK-2细胞凋亡率显著升高,细胞中caspase-3和caspase-9活性明显升高,TNF-α含量亦明显升高(P 0. 05);下调VDUP-1表达后的HK-2细胞经高糖处理后细胞凋亡率显著降低,细胞中caspase-3和caspase-9活性也明显降低(P 0. 05)。高糖培养后细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平下降,而下调VDUP-1表达部分拮抗高糖对HK-2细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh表达的影响。外源性Shh可以促进细胞中Ptch1、Smo和Gli2的表达,抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和分泌TNF-α,与下调VDUP-1共同抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。结论:干扰VDUP-1表达可能通过激活Shh信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和分泌TNF-α。     

活性氧与丝裂原激活蛋白激酶通路的相互作用介导高糖引起的心肌细胞损伤

目的探讨活性氧(ROS)与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路的相互作用在高糖损伤H9c2心肌细胞中的作用。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态及数量的改变;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相检测细胞内ROS水平;Western blot测定蛋白质表达水平。结果高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞24 h可引起明显的损伤,表现为细胞存活率下降,凋亡细胞数量及ROS水平明显升高。另方面,高糖可明显地上调磷酸化(p)p38MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及c-Jun N端激酶(JNK)(为MAPK家族的3个成员)的表达水平。N-乙酰半胱氨酸(NAC,为ROS清除剂)能抑制高糖引起的心肌细胞毒性和细胞凋亡,也能阻断高糖对p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK表达的上调作用。此外,p38MAPK、ERK1/2和JNK的选择性抑制剂均能抑制高糖引起的心肌损伤,并能抑制ROS生成增多。结论在高糖损伤H9c2心肌细胞中,存在ROS与MAPK通路的正相互作用,这种相互作用可能在高糖引起的心肌细胞损伤中起着重要的作用。     

血小板源性生长因子受体α影响过氧化氢诱导的黑素细胞凋亡

目的:探讨血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的黑素细胞凋亡的影响。方法:以黑素细胞PIGI为研究对象,分别用不同浓度的H_2O_2作用后,用MTT法检测细胞活力,并计算半数抑制浓度。经H_2O_2处理的PIGI细胞转染空载体p CMV6或PDGFRα过表达载体p CMV6-PDGFRα,以不做转染的细胞为空白对照,RT-q PCR和Western blot检测转染效率。用半数抑制浓度的H_2O_2作用于过表达PDGFRα的PIGI细胞,MTT法检测细胞活力,绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测细胞中p38、磷酸化p38(p-p38)和cleaved caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCDHF-DA)法检测细胞中活性氧簇(ROS)水平。结果:H_2O_2作用后PIGI细胞生长减慢,细胞凋亡率升高,细胞中ROS水平、p-p38和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P0.05),H_2O_2的半数抑制浓度为0.7 mmol/L。PDGFRα过表达载体能够成功上调PIGI细胞中PDGFRα的mRNA和蛋白水平(P0.05)。过表达PDGFRα后经过H_2O_2处理的PIGI细胞存活率升高(P0.05),细胞凋亡率下降(P0.05),细胞中的ROS水平下降(P0.05),p-p38和cleaved caspase-3蛋白水平降低(P0.05)。结论:PDGFRα能够抑制H_2O_2诱导的黑素细胞凋亡,部分逆转H_2O_2对黑素细胞增殖的抑制作用,降低细胞中的ROS水平,其作用机制可能与p-p38和cleaved caspase-3蛋白水平的变化有关。     

黄芪多糖对糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡、转分化及ROS 含量的影响研究

目的:探讨黄芪多糖对糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡、转分化及ROS 含量的影响。方法:HK-2 细胞分为低糖组、高糖组和黄芪多糖+高糖组,处理细胞48 h 后,CCK-8 实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡及ROS 含量;Western blot 检测E-cadherin、α-SMA、STAT1、STAT3、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达。结果:高糖组细胞存活率显著低于低糖组(P<0.01),细胞凋亡率、ROS 含量及E-cadherin、α-SMA、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达均显著高于低糖组(P<0.01),高糖+黄芪多糖组细胞存活率显著高于高糖组,细胞凋亡率、ROS 含量及E-cadherin、α-SMA、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达均显著低于高糖组(P<0.01)。结论:黄芪多糖可促进高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡及转分化,其机制与下调JAK/ STAT 信号通路有关。     

京尼平抑制高糖诱导的大鼠心肌H9c2细胞氧化应激及凋亡损伤

目的:探讨京尼平(genipin,GEN)对高糖损伤的大鼠心肌H9c2细胞的抗氧化作用和抑制细胞凋亡的机制。方法:体外培养大鼠心肌H9c2细胞,高浓度(50 mmol/L)葡萄糖处理H9c2细胞建立细胞损伤模型,分为正常糖对照组(NC组,葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖损伤组(HG组,葡萄糖浓度为50 mmol/L)、正常糖+京尼平组(NC+GEN组)和高糖+京尼平组(HG+GEN组,京尼平浓度为10μmol/L)。CCK-8法检测细胞活力;酶标法和WST-1法分别测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;微板法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;荧光探针DCF检测细胞内活性氧簇(ROS)水平;ELISA法检测核小体片段的聚集值;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞内线粒体膜电位变化;利用Western blot法检测线粒体内抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),以及早期凋亡蛋白细胞色素C(Cyt C)、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与HG组比较,HG+GEN组细胞活力显著升高(P 0.05),细胞内MDA的含量及细胞上清液中LDH的活性明显降低(P 0.05),细胞内SOD活性升高(P 0.05),细胞内线粒体膜电位明显升高(P 0.05),ROS水平降低(P 0.05),核小体片段聚集程度显著降低(P 0.05)。HG组线粒体内抗氧化酶Mn-SOD比NC组降低(P 0.05),但线粒体内凋亡蛋白Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平比NC组显著升高(P 0.05),而HG+GEN组与HG组相比,Mn-SOD升高(P 0.05),Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著降低(P 0.05)。结论:京尼平对高糖损伤的心肌H9c2细胞具有抗氧化保护作用和抑制细胞凋亡的作用。     

麝香保心丸通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号传导通路表达对抗高糖诱导的心肌细胞损伤

目的探讨麝香保心丸(SBP)是否通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路保护H9c2心肌细胞对抗高浓度葡萄糖(高糖,HG)引起的损伤。方法应用35 mmol/L的HG处理H9c2心肌细胞24 h,建立HG诱导的心肌细胞损伤模型;细胞计数试剂盒8测定细胞存活率;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定细胞凋亡;双氯荧光素(2’,7’-dichlorfluorescein-diacetate,DCFH-DA)染色/荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(ROS)水平;罗丹明123(Rh123)染色法测定线粒体膜电位(MMP);Western blot法测定p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达水平。结果 HG处理H9c2心肌细胞24 h能引起细胞明显的损伤,使细胞存活率降低,凋亡细胞数量和细胞内ROS生成增多,MMP丢失;HG能增加p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平;SBP预处理能明显抑制HG上调p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平这一作用;SBP、p38MAPK通路抑制剂SB203580和NF-κB通路抑制剂PDTC均能阻断HG对心肌细胞的上述损伤作用,包括细胞毒性、凋亡、ROS生成增多及MMP丢失等。结论麝香保心丸(SBP)可通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号传导通路保护H9c2心肌细胞对抗高糖(HG)引起的损伤。     

PHB 对高糖环境下的心肌细胞中活性氧及细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨抗增殖蛋白(PHB)对高糖诱导的H9C2 心肌细胞凋亡的影响以及机制研究。方法:选取pCDNA3-PHB、pCDNA3-NC 重组质粒转染和高糖干预心肌细胞,实验分为4 组:正常对照组(Control 组)、高糖刺激组(HG 组)、高糖+空载体组(HG+pCDNA3-NC 组)、高糖加pCDNA3-PHB 重组质粒组(HG+pCDNA3-PHB);Western blot 检测细胞转染后各组细胞中PHB 蛋白、B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2 相关X 蛋白(Bax) / B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2(Bcl-2)、剪切的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(c-caspase3)、蛋白激酶B(AKt)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKt)蛋白的表达量,二氢乙啶(DHE)染色法检测高糖环境下心肌细胞内的活性氧(ROS)水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中TNF-αmRNA 和IL-6 mRNA 含量的测定,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:pCDNA3-PHB 重组质粒可使PHB 表达量增加;与Control 组相比,HG 组、HG+pCDNA3-NC 组、HG+pCDNA3-PHB 组细胞凋亡率显著增高(P<0.05);与HG 组相比,HG+pCDNA3-NC 组细胞凋亡率变化不显著(P>0.05); HG+pCDNA3-PHB 组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与Control 组相比,HG 组HG+pCDNA3-NC 组、HG+pCDNA3-PHB 组细胞内ROS 的水平、TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、Bax/ Bcl-2 的相对表达量、c-caspase3(P<0.05)蛋白相对表达量显著增高;与HG组相比,HG+pCDNA3-NC 组细胞内ROS 的水平( P>0.05)、TNF-αmRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/ Bcl-2 的相对表达量(P>0.05)、c-caspase3 蛋白相对表达量(P>0.05)无明显差异;但pCDNA3-PHB 组细胞中ROS 的水平(P<0.05)、TNF-琢mRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/ Bcl-2 的相对表达量(P<0.05)、c-caspase3(P<0.05)蛋白相对表达量明显降低。经统计分析显示,各组细胞中AKt 蛋白的相对表达量无显著差异(P>0.05)。经比较后,HG 组、HG+pCDNA3-NC 组、HG+pCDNA3-PHB 组心肌细胞中p-AKt 蛋白的相对表达量显著低于Control 组(P<0.05);HG+pCDNA3-NC 组心肌细胞中p-AKt 蛋白的相对表达量与HG 组间无显著差异(P>0.05);但HG+pCDNA3-PHB 组心肌细胞中p-AKt 蛋白的相对表达量明显高于HG组(P<0.05)。结论:PHB 过表达可抑制高糖环境下H9C2 心肌细胞的凋亡和炎症反应,主要是通过调控PI3K/ Akt 信号通路、ROS、Bax/ Bcl-2、c-caspase3 蛋白的水平,为糖尿病心肌病的治疗提供新的思路与方法。     

坏死性凋亡介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤

目的:研究坏死性凋亡是否介导高糖(HG)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤。方法:CCK-8法检测细胞存活率;Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)、cleaved caspase-3的蛋白水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的水平。结果:应用不同浓度葡萄糖(10、20和40 mmol/L)处理HUVECs 24 h,RIP3的蛋白水平随葡萄糖剂量增加而升高,40 mmol/L时达高峰;应用40 mmol/L葡萄糖处理HUVECs 3 h、6 h、9 h、12 h和24 h能上调RIP3的蛋白水平,于9 h达最高峰;应用20μmol/L凋亡蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理HUVECs 30 min促进RIP3表达;应用100μmol/L坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1预处理HUVECs 1 h能抑制HG诱导HUVECs的细胞存活率降低,ROS过度生成及MMP丢失,但能升高cleaved caspase-3的蛋白水平。结论:坏死性凋亡介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤,但与内皮细胞凋亡存在负相关。     

Synthetic liver X receptor agonist T0901317 attenuates high glucose-induced oxidative stress,mitochondrial damage and apoptosis in cardiomyocytes

The aim of the present study was to investigate the protective effects of T0901317 (T0), a potent agonist of liver X receptors (LXRs), on high glucose-induced oxidative stress and apoptosis in H9c2 cardiac cells. Exposure of H9c2 cells to high glucose alone, not only caused a significant increase in apoptosis and reactive oxygen species (ROS) generation, but also led to a decrease in mitochondrial membrane potential (ΔΨm), release of cytochrome c, decrease in Bcl-2, increase in Bax expression and the activation of caspase-3, caspase-9, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) and nuclear factor (NF)-κB. However, pretreatment with T0 effectively decreased apoptosis, reduced the levels of ROS, abrogated ΔΨm, inhibited cytochrome c release and NF-κB activation, increased Bcl-2 and decreased Bax expression. In conclusion, our data suggest that T0 exerts protective effects against high glucose-induced apoptosis in H9C2 cardiac muscle cells via inhibition of ROS production, mitochondrial death and NF-κB activation.     

MCU在高糖诱导心肌H9c2细胞凋亡中的作用机制

目的:探讨线粒体钙离子单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)在高糖(high glucose,HG)诱导心肌H9c2细胞凋亡中的作用机制。方法:将心肌H9c2细胞随机分为3组:对照(control)组,5.5 mmol/L葡萄糖处理细胞;HG组,25 mmol/L葡萄糖处理细胞;精胺(spermine,Sp)干预(HG+Sp)组,25 mmol/L葡萄糖和5μmol/L Sp共同处理细胞。Western blot检测H9c2细胞MCU、caspase-9和caspase-3蛋白的表达;RT-qPCR检测H9c2细胞MCU的mRNA水平;Rhod-2 AM探针检测线粒体内Ca2+的荧光强度;吸光度法检测丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)的活性;萤火虫萤光素酶检测细胞裂解液ATP的浓度;JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm);MitoSOXTM染色法检测线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平。结果:与control组相比,HG组MCU mRNA和蛋白水平、线粒体内Ca2+浓度、PDH活性、细胞ATP浓度及Δψm降低(P<0.05),而ROS水平及caspase-9和caspase-3凋亡蛋白表达增加(P<0.05);与HG组相比,HG+Sp组线粒体内Ca2+浓度、PDH活性、细胞ATP浓度和Δψm增加(P<0.05),而ROS水平及caspase-9和caspase-3凋亡蛋白表达降低(P<0.05)。结论:高糖通过降低MCU表达导致其活性下降,从而促进心肌H9c2细胞凋亡,其机制可能与线粒体的钙离子稳态失衡、三羧酸循环障碍和线粒体功能损伤有关。     

青蒿琥酯通过增加活性氧簇生成诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

目的:探讨青蒿琥酯诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的机制及活性氧簇(ROS)在青蒿琥酯诱导Hep G2细胞凋亡中的作用。方法:采用MTT法观查青蒿琥酯对人肝癌Hep G2细胞存活的影响,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡形态的变化,流式细胞术检测Hep G2细胞的凋亡率,DCFH-DA检测细胞凋亡过程中ROS的变化。Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和细胞色素C(Cyt C)蛋白水平的变化。采用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)预处理Hep G2细胞,Western blot检测NADPH氧化酶亚基p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达水平,流式细胞术检测ROS变化。结果:与对照组相比,青蒿琥酯作用于Hep G2细胞24 h后,细胞存活率明显减少(P0.05);细胞核呈致密浓染色,细胞凋亡比例升高(P0.05);ROS明显升高(P0.05);Western blot结果显示,青蒿琥酯作用后细胞内Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高,cleaved caspase-3和Cyt C蛋白水平升高。Apocynin预处理能降低青蒿琥酯给药组细胞内p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达及ROS的生成。结论:青蒿琥酯能诱导Hep G2细胞凋亡,其凋亡过程可能与ROS的生成增加相关。     

尼古丁促进高糖/高脂培养的大鼠心肌细胞系H9C2凋亡

目的研究在不同浓度尼古丁(Nic)条件下高糖/高脂(HGHL)对大鼠心肌细胞系H9C2凋亡的影响。方法体外培养H9C2细胞,给予不同浓度Nic(6×10^-8、6×10^-7、6×10^-6mol/L)2 h后,HGHL(33 mmol/L葡萄糖和500μmol/L棕榈酸酯)培养24 h,CCK8法检测细胞增殖;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞活力;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3及caspase3的表达及ERK1/2、JNK和p38MAPK磷酸化水平;流式细胞计量术测定细胞凋亡和上清液ROS水平。结果与对照组相比,HGHL和尼古丁联合HGHL均显著抑制细胞活力,增加上清液中LDH水平(P<0.001);HGHL及Nic+HGHL细胞凋亡率显著增加(P<0.001)及cleaved-caspase3蛋白表达明显增加(P<0.01);Bcl-2/Bax蛋白表达显著下降(P<0.01);在Nic+HGHL组,ROS水平表达最显著(P<0.001);HGHL能激活MAPK磷酸化,Nic+HGHL组ERK1/2磷酸化水平显著升高(P<0.01);ROS清除剂(NAC)能显著减少caspase3蛋白表达水平(P<0.001)。结论尼古丁、HGHL能导致H9C2细胞损伤并增加其凋亡,其发生与ROS及MAPK信号通路密切相关。