三七片DNA条形码分子鉴定及方法学考察

目的为研究DNA条形码技术在中成药鉴定中的应用,以三七片为研究对象,对方法的适用性、专属性与精密度进行考察。方法收集15批次市售三七片样品,考察三七片DNA提取条件,并对"中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则"中PCR扩增、序列获得、结果判定等方法适用性进行确认;收集三七、人参、西洋参,制作三七片及其掺伪品,考察方法的专属性和重现性。结果三七片取样量100 mg,56℃水浴8 h所获得DNA的质量浓度平均值为60.7 ng/μL,PCR扩增、序列获得和结果判定均可获成功;三七、人参和西洋参的ITS2序列长度均为230bp,三七与人参、三七与西洋参的序列间均存在7个稳定的SNP位点,自制三七片和掺伪三七片均可成功获得ITS2序列,不同比例三七与人参、三七与西洋参的测序峰图在SNP位点处呈现相应峰高比的SNP套峰具备专属性;重复性、中间精密度和重现性考察符合《中国药典》2015年版(通则9101)相关要求。结论 ITS2序列作为DNA条形码能够稳定、准确鉴定三七片的原料药材,具备良好的专属性和精密度,三七片DNA条形码分子鉴定法将为保障三七片临床用药安全提供新的技术手段,并对《中国药典》其他收载单方制剂的鉴定提供参考。     

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的：查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法：查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果：当退火温度为66 ℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论：多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。     

多重位点特异性PCR鉴别人参、三七、西洋参掺杂

为建立一种能同时鉴别人参、三七、西洋参及其掺杂品的方法。通过分析人参属ITS,18S和matK序列,寻找特异性SNP位点设计引物,建立多重位点特异性PCR法,并对不同来源的人参、三七、西洋参样品进行扩增,根据特异性条带大小进行鉴别。在退火温度为60℃,循环数为35时,人参、三七和西洋参分别出现约250,500,1000 bp的特异性条带。该方法对于人参、三七、西洋参相互掺杂的混合样品,人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%,对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%,掺杂三七的检出限为1%。表明建立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂鉴定。     

Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究

目的：采用高分辨率熔解曲线技术（HRM）,应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段。方法：收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列。在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品。结果：通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参。进而将其PCR 产物测序,以验证该结果。结论：Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测。     

基于SNP双峰法的人参花 西洋参花 三七花及其混合物的快速鉴定

目的:建立人参花、西洋参花、三七花及两两之间混合物的快速鉴定方法。方法:收集市售人参花、西洋参花和三七花共计22份,获取样品内转录间隔区2(ITS2)序列。通过数据比对发现,在19~47 bp存在这3种花的单核苷酸多态性(SNP)位点,据此建立混合粉末的双峰法检测方法,判断混合物的物种组成。结果:市售22份商品的DNA条形码序列经BLAST鉴定均为正品,但经SNP位点分析发现,有2份西洋参花样品(S1和S7)SNP位点处出现双峰[胸腺嘧啶(T)/胞嘧啶(C)]、(C/T),判断掺杂有人参花。结论:SNP双峰法可以作为BLAST分析的补充手段,应用于混合物的鉴定,为花茶类产品的市场监管提供参考。     

采用巢式PCR-直接测序法分析人参达玛烯二醇合成酶基因单核苷酸多态性

目的建立人参皂苷生物合成通路中的关键酶——人参达玛烯二醇合成酶(DS)基因c DNA序列的单核苷酸多态性(SNP)检测方法,为人参属植物DS基因的SNP研究以及人参类药材的品种鉴定提供参考。方法采集不同产地、不同品种和生长年限的人参样品,提取RNA,逆转录为c DNA。采用巢式PCR进行扩增,根据人参DS基因c DNA保守序列设计1组引物用于第1轮PCR,2组DS基因上下游分段引物用于第2轮PCR,扩增产物直接测序。测序结果经BLAST同源性比较后,采用DNAMAN软件进行多重比对分析,以发掘不同样品间DS基因差异位点作为候选SNP。结果 57份人参样本共获得111个符合测序要求的DS基因上下游分段PCR产物,其中测序成功103个,序列经BLAST判定为人参DS基因,经多重比对,发现6个样品存在7个SNP位点。结论建立了巢式PCR-直接测序法发掘人参DS基因cDNA序列的SNP,方法具有特异性好、操作简单、结果准确等优点。可用于检测人参样品的DS基因是否含有SNP及其类型,这可为人参及其相关药材和产品的质量评价新方法研究提供有价值的遗传研究工具和分子标记资源。     

苦水玫瑰ITS及ITS2序列分析与鉴别

目的:对苦水玫瑰、平阴玫瑰、月季、金边玫瑰、法兰西玫瑰进行DNA条形码序列比对,对苦水玫瑰予以鉴别。方法:对样本的细胞核基因内转录间隔区(ITS)和ITS2片段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并双向测序,所得序列经Codon Code Aligner 3.7.1软件拼接后,用MEGA 5.0软件进行序列的分析比对,采用邻接法(NJ)构建系统聚类树。结果:ITS引物扩增产物中大部分样品的测序结果双峰严重,无法有效拼接,可用数据量低,含不确定性碱基比例高,因此未对该部分数据进行分析;平阴玫瑰与对照药材均可获得高质量的ITS2序列,且序列完全一致,苦水玫瑰的ITS2序列(序列6和8)与平阴玫瑰及玫瑰对照药材相比存在1～2个变异位点,月季、法兰西玫瑰与平阴玫瑰及玫瑰对照药材相比存在≥2个变异位点。结论:利用ITS2序列能够有效区分苦水玫瑰及其他同属物种样品。     

蒙古黄芪与膜荚黄芪特异性分子标记鉴别研究

目的:通过分析不同基原中药黄芪样本DNA序列,研究特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的方法。方法:通过筛选5条常用DNA条形码序列(ITS,ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK),运用MEGA软件进行序列比对,分析可特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的序列及SNP位点,并设计特异性引物。结果:ITS及ITS2序列可准确区分蒙古黄芪与膜荚黄芪,发现稳定的SNP位点,蒙古黄芪在ITS序列第476位点(位于ITS2序列上游)为碱基C,而膜荚黄芪为碱基T,并设计三对特异性鉴别蒙古黄芪的引物对。结论:ITS/ITS2序列以及特异性引物可准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪,为黄芪药材的基原鉴定提供科学依据。     

基于rDNA-ITS序列及相似度分析的中药赤芍分子鉴别研究

目的:分析中药赤芍正品及混伪品ITS序列的种内相似度及特定位点序列碱基差异,为建立中药赤芍的分子鉴别标准提供思路。方法:采用PCR扩增产物直接测序的方法对市场上购得的未知来源赤芍样品S1、S2的ITS序列(包括ITS1,ITS2,5.8S)进行测定,测定结果进行BLAST比对、相似度分析、序列特异性碱基位点差异比较;用DNAMAN对GenBank上已注册的正品赤芍和混伪品赤芍的ITS序列进行分析。结果:建立了赤芍药材分子鉴别的3个指标,即根据BLAST结果定属,种内相似度缩小属内范围并定种,再通过特异性碱基位点差异最终确定并证实样品的物种;确定了样品S1来源于芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.,样品S2来源于芍药属植物川赤芍Paeonia veitchii Lynch.。结论:本文为赤芍的分子鉴别提供较为有效的思路与方法,同时为基于rDNA-ITS相似度及序列分析进行其他中药品种鉴别提供依据。     

基于SNP位点鉴定砂仁药材物种

目的：为建立基于单核苷酸多态性（SNP）技术鉴别砂仁3 个基原（阳春砂Amomum villosum、海南砂Amomum longiligulare、绿壳砂Amomum villosum var.xanthioides）的方法,对这3 个种共计60 份材料ITS2 序列进行分析比较。方法：将实验所得砂仁ITS2 序列,应用CodonCode Aligner 软件进行序列拼接比对。用MEGA 5.0 导出各序列变异位点,并对变异位点进行分析。为验证结果准确性,下载砂仁3 个基原GenBank 的所有ITS2 序列,共计34 条,对结果进行验证。结果：砂仁ITS2 序列比对后长度为230 bp,3个不同基原在135 bp 和199 bp 处存在稳定SNP（s）变异位点。结论：本研究开发的两个稳定的SNP（s）位点可以快速准确地鉴定砂仁药材3 个基原。     

基于ITS2序列的人参及同属易混品西洋参种子的分子鉴定

目的基于DNA条形码技术建立人参与西洋参种子的分子鉴别方法。方法采用生药鉴定方法研究其性状、显微特征,并结合DNA条形码技术,基于中药材DNA条形码数据库,通过ITS2序列比对、遗传距离比较和构建临接(NJ)系统发育树,对人参与西洋参的种子进行鉴别研究。结果人参与西洋参种子的种内遗传距离分别小于种间遗传距离,系统发育树图中各物种均聚为一支,来自9个产地的42份人参及西洋参的种子均为正品,且容易区分。结论基于ITS2序列DNA条形码技术可以快速、准确、有效地鉴别人参与西洋参种质资源。     

三七花及其易混淆品的微性状鉴别

目的:研究市售五加科植物三七(Panax notoginseng),人参(P.ginseng),西洋参(P.quinquefolius)的干燥花序的微性状特征,为该类药材的微性状鉴别提供科学的理论依据。方法:利用中药微性状鉴定法对市场上销售的3种花序的不同部位运用电子目镜进行拍照,采用Photoshop CS6软件程序合成高清晰度微性状特征图片来对微性状特征进行鉴别研究,并对其表面微性状特征进行描述。最后归纳、总结出各药材的鉴别要点。结果:微性状鉴别较明显的区别点集中在总花梗、小花梗、雌蕊方面,其中三七花总花梗和小花梗表面有非腺毛,小花梗表面白色突起呈不规则排列,雌蕊柱头分开,并且含有棕黄色树脂道;人参花总花梗和小花梗表面无非腺毛,雌蕊柱头常不分开,含不明显的黄色树脂道;西洋参花总花梗和小花梗表面有非腺毛,小花梗表面白色突起呈规则排列,雌蕊柱头不分开,无明显树脂道。结论:通过微性状鉴别法,可以清楚地看出各部位的微性状特征,能有效的对三七花、人参花、西洋参花进行区别,为三七花的真伪鉴别及质量评价提供依据。     

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力。方法:选择psbA-trnH,rbcL,matK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcod-ing gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力。结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6%,83.6%,96.4%,98.2%,其鉴定成功率除rbcL为77.8%,75.9%外都为100%,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势。ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5%,87.6%。结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合。     

东北不同产地人参及其加工品外观性状及非皂苷类成分比较分析

目的:考察东北不同产地人参及其加工品的外观性状以及水分、灰分、浸出物、挥发油含量,为其质量标准的制定和适宜种植的区域提供可供参考的依据。方法:参考药典和相关文献,分别测定10个不同产地生晒参以及红参的外观性状、水分、灰分、浸出物、挥发油含量,并对各检测指标进行DTOPSIS分析。结果:长白、集安、抚松3个产地的生晒参和红参在各项检测指标中均达到了药典标准和国标要求,并且在DTOPSIS分析中得到的综合评价值较高。结论:不同产地的生晒参以及红参的药材质量差异较大,部分产地生晒参和人参尚未达到药典标准和国标要求。本研究所测定各项指标较优的3个产地人参都来自人参GAP规范化种植基地,由此反应了GAP规范化种植对于保证人参质量的重要性。     

人参内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选

本研究用平板培养法从人参Panax ginseng根中分离内生细菌,共分离到40种内生细菌,Bacillus spp.和Pseud-omonas spp.为优势内生菌。通过对峙培养,筛选出对人参菌核菌、人参锈腐菌和人参黑斑菌均有明显抑制作用的内生细菌ge15 Stenotrophomonas maltophilia和ge25 Bacillus sp.,其中ge15对人参菌核菌、人参锈腐菌和人参黑斑菌的抑菌带宽度分别达5.5,22.0,14.8 mm;ge25对3种致病菌的抑菌带宽度分别达12.7,16.5,9.0 mm。研究结果表明,内生细菌具有防控人参致病菌的生防潜力,可作为生防因子用于人参土传病害的防治。     

鼓泡式生物反应器培养人参不定根的研究

目的:研究鼓泡式生物反应器对人参不定根培养的影响.方法:利用组织培养技术结合高效液相色谱法和紫外分光光度法,考察不同角度的鼓泡式生物反应器对人参不定根生长及人参不定根有效成分皂苷和多糖合成的影响.结果:不同生物反应器培养人参不定根中,适合培养人参不定根生长的最佳反应器类型为120°圆锥型鼓泡式生物反应器.测定120°圆锥型反应器内的人参不定根生长呈典型的“S”型曲线.人参不定根在第40天得到最大的生物量,并且鲜重、干重、干重增殖倍数都达到了最大值,分别为113.15 g,9.62 g,63.13倍.人参不定根总皂苷和多糖质量分数为2.25 mg·g-1和2.73％.结论:适合培养人参不定根的最佳反应器为120°圆锥型鼓泡式生物反应器.该实验为工业化生产人参有效活性成分奠定基础.     

获取人参、西洋参特定序列位点(STS)标记的新方法

目的：寻找人参、西洋参的分子鉴定新方法。方法：在人参、西洋参已知rDNA序列上设计单引物进行PCR扩增,对多态性条带克隆测序,根据序列比对情况设计人参、西洋参特异引物,通过对PCR条件的优化得到人参、西洋参的STS 标记。结果：引物Pg-q36F能得到人参、西洋参的多态性条带,特异引物Pg-6F,Pg-479R仅对人参扩增474 bp条带,特异引物Pq-442F,Pq-658R仅对西洋参扩增217 bp条带,能成功鉴定人参和西洋参。结论：建立了一种获取人参、西洋参STS标记的新方法。本方法大大加快STS标记的建立过程,可为其他中药材分子标记的获得提供指导。     

基于ITS2条形码鉴定柴胡与大叶柴胡

为准确鉴定柴胡与大叶柴胡,该研究共48份柴胡、大叶柴胡药材,扩增ITS2 序列并进行测序,采用CodonCode Aligner软件进行序列拼接,用软件MEGA5.0分析比对确定不同的单倍型,并基于K2P模型进行遗传距离等分析。采用相似性搜索法、最近距离法、构建邻接树（NJ树）法对柴胡与大叶柴胡进行鉴定。结果显示柴胡与大叶柴胡种间最小K2P距离为0.049,远远大于柴胡种内最大K2P距离0.013。NJ树显示大叶柴胡独自聚为一支,可明显与柴胡区分。因此应用ITS2条形码可以准确鉴定柴胡及大叶柴胡。     

透析法制备低相对分子质量人参糖肽的工艺及其性质考察

目的:探讨透析法制备低相对分子质量人参糖肽的工艺,并对其理化性质、纯度与相对分子质量分布进行研究.方法:以理化性质及收率为考察指标,单因素试验对透析制备低相对分子质量人参糖肽的工艺进行考察,采用HPLC及GPC软件测定纯度与分子量分布.结果:制备工艺确定为采用截流相对分子质量1000 Da透析袋,加入6L水透析4h.制备的人参糖肽总糖肽质量分数92.49％,收率18.95％,确定为相对分子质量在300-3 500 Da的混合物.结论:采用透析法制备低相对分子质量人参糖肽操作简便易行,总糖肽含量较高,相对分子质量较低.     

基于中药系统鉴别法的金铁锁及其混淆品的精确鉴别

目的:建立金铁锁药材及其混淆品有效的鉴别方法,分析二者在显微特征、DNA信息特征等方面的差异,为精确鉴定金铁锁药材及其混淆品,以保障用药安全奠定基础.方法:采用中药系统鉴定,对金铁锁药材及其市售混淆品样本的显微特征及其ITS序列进行BLAST比对分析、ITS序列的特异位点差异分析,N-J系统发育树分析等,建立金铁锁及其混伪品的系统鉴定方法.结果:中药系统鉴定法的显微特征中,金铁锁正品药材中无草酸钙结晶,而其混淆品瓦草中具有大量的草酸钙簇晶分布,可作为其鉴定的重要依据之一;此外,金铁锁药材ITS序列与瓦草ITS序列差异明显,采用BLAST比对分析、N-J系统发育树分析等可将二者进一步精确鉴别.结论:采用中药系统鉴定法能够很好的对金铁锁及其混伪品进行精确的鉴别.