多重探针连接依赖式扩增技术在常见非整倍体染色体异常快速产前诊断中的应用研究——附407例检测报告

目的:评估现有多重探针连接依赖式扩增技术(MLPA)方案作为常见非整倍体染色体异常的快速产前诊断方法的有效性.方法:对407例羊水样本进行MLPA试验及羊水细胞染色体G显带核型分析,所有样本进行MLPA获得的扩增产物信息经GenemarkerV l.80软件进行定量分析,观察样本DNA拷贝数的变化,并将所得结果与染色体核型分析结果进行比较,计算其检测的敏感度、特异度及阳性预测值.结果:407例样本中,应用MLPA技术发现正常样本397例及染色体非整倍体异常样本9例.异常结果包括21三体6例、18三体l例、X三体1例及X-单体1例,与羊水细胞培养染色体G显带核型分析结果一致.MLPA检测出的1例X单体疑似样本,经核型分析结果验证为正常核型.MLPA检测非整倍体性染色体异常的敏感度为100％,特异度为99.75％,阳性预测值为90％.结论:MLPA分析技术作为一项快速产前诊断技术,具有良好的特异性和应用价值.     

磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。     

多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用

多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation—dependent probe amplification,MLPA）是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交（hybridization）、连接（1igation）及PCR（polymerase chain reaction）扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化。凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述。     

多重连接探针扩增技术的研究进展及其应用

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependentprobe amplification,MLPA)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。该技术仅需20ng/μlDNA,即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤,在同一反应管中对四十多个不同的靶基因进行检测和定量分析。这一技术最先于2002年由荷兰的Schouten等[1]报道。如今短短几年中,该技术已被欧洲、亚洲等几十个实验室采用。迄今为止,已有150多篇不同领域采用该技术方法的报道在重要刊物上发表。     

采用多重连接依赖式探针扩增技术对先天性心脏病患儿进行基因拷贝数变异分析

目的 探讨多重连接依赖式探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在临床上检测先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)患者基因拷贝数变异(copy number variation,CNV)的可行性,了解中国未挑选的先天性心脏病患儿中基因拷贝数变异的发生情况.方法 收集未挑选的125例先天性心脏病患儿,以100例年龄、性别匹配的健康儿童为正常对照组,采用MLPA技术(MLPA-kit P311试剂盒)对病例组和对照组的基因组DNA进行分析. 结果 在125例先天性心脏病患儿中,发现5个22q11.2微缺失,阳性检出率为4％(5/125).在100例正常对照中均未检出拷贝数变异. 结论 CNV是CHD的重要致病机制,而22q11微缺失是CHD患者中常见的CNV的类型之一.MLPA技术具有高通量、快捷及成本较低等特点,可应用于先天性心脏病基因拷贝数异常的检测.     

多重连接依赖探针扩增技术在染色体非整倍体快速产前诊断中的应用

目的 探讨多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在大样本羊水染色体非整倍体快速产前诊断中的临床应用前景.方法 收集自2009年10月至2010年12月在深圳市妇幼保健院产前诊断中心进行染色体异常产前诊断的孕妇羊水标本1229份,采用MLPA技术对5种常见染色体非整倍体异常(即13、18、21、X和Y染色体非整倍体)进行快速分子诊断,同时进行G显带染色体核型分析双盲检测.然后比较两种方法的检测结果,验证MLPA技术的敏感性和特异性.结果 在1229份羊水标本中,G显带核型技术确诊5种染色体非整倍体标本38份,其中非嵌合体非整倍体标本34份,非整倍体嵌合体标本4份;MLPA技术检测非嵌合体非整倍体与G显带核型分析结果一致,MLPA技术检出2份非整倍体嵌合体,漏检2份非整倍体嵌合体.结论 MLPA技术对13、18、21、X和Y非嵌合体非整倍染色体异常的检测敏感度和特异度较好,可应用于染色体非整倍体快速产前诊断.     

多重PCR法检测Y染色体微缺失

目的探讨多重PCR法检测Y染色体微缺失对男性不育患者的病因学诊断价值。方法采用多重PCR法检测男性不育患者和正常男性Y染色体AZF座位的缺失情况。结果106例患者中Y染色体微缺失28例,缺失率26.4%,30例正常男性Y基因均未发现缺失。结论Y染色体微缺失是不明原因性无精子症或严重少精子症的病因之一,多重PCR检测技术具有快速、高效、灵敏度高等特点。     

多重连接探针扩增技术在2例罕见Rh部分D表型等位基因检测中的应用

目的 探讨多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术在2例罕见Rh部分D表型等位基因检测中的应用.方法 选择2012年4月和9月外院送广州血液中心进行RhD血型鉴定的2例受检者全血样本作为研究对象.对其进行常规血清学方法鉴定RhD血型后,提取全血标本的DNA.采用MLPA技术对上述2例受检者的RHD和RHCE基因进行检测,分析RHD和RHCE基因的外显子拷贝数、点突变、基因缺失及杂交融合情况,并将MLPA技术检测结果与常规血清学及序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)检测结果进行对比.结果 受检者全血标本MLPA结果显示其RHD、RHC、RHc基因拷贝数均为1.0,RHE基因拷贝数为0,RHe基因拷贝数为3.0,D03-380T、D03-455A、D04-602C、D05-667T、D04-514A、D05 787G基因外显子拷贝数均为0,即RHD基因外显子3～5完全缺失.PCR SSP结果亦显示受检者RHD基因外显子3～5缺失,检出C、c、e基因;血清学结果显示受检者红细胞与2种单克隆抗D在试管中均有2+的凝集,Rh血型其他抗原分型为C+ c+E e+.2例受检者全血标本MLPA技术,常规血清学及PCR-SSP检测结果基本一致.结论 2例受检者属中国人群中首次发现的Rh部分DⅥtype 4型血型;MLPA技术作为检测基因点突变、基因缺失、等位基因杂交融合和基因拷贝数的新技术,可用于Rh血型D抗原变异型的等位基因检测.     

多重连接探针扩增技术在胚胎停止发育染色体非整倍体异常分析中的应用

目的：探讨多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）技术在分析胚胎停止发育（以下简称胚胎停育）流产绒毛组织染色体非整倍体异常中的应用,探讨染色体非整倍体异常导致胚胎停育与胎儿性别、患者年龄间的关系。方法：收集324例临床诊断为胚胎停育患者的流产绒毛组织,采用MLPA技术进行染色体检测,并分析检测结果与胎儿性别及患者年龄间的相关性。结果：在324例胚胎停育患者中,检出绒毛染色体非整倍体异常共68例（20.99%）,其中常染色体三体33例（13-三体12例、18-三体6例、21-三体15例）,常染色体缺失3例（13-单体1例、21-单体2例）,性染色体数目异常32例（45-XO 15例、47-XXY 13例、47-XXX 1例、47-XYY 3例）。常染色体数目异常组与染色体数目正常组间的胎儿性别分布差异无统计学意义（P>0.05）。对绒毛染色体数目正常组[平均年龄（32±6）岁]、常染色体数目异常组[平均年龄（34±7）岁]、性染色体数目异常组[平均年龄（28±6）岁] 3组患者的年龄进行比较,发现差异有统计学意义（P<0.05）。结论：MLPA技术可以作为一种辅助检测手段,用于检测胚胎停育流产绒毛组织染色体的非整倍体异常,染色体数目异常导致的胚胎停育与胎儿的性别无关,但与患者的年龄有关,胚胎常染色体数目异常组的孕妇年龄大于染色体数目正常组及性染色体数目异常组。     

男性不育患者Y染色体微缺失筛查与意义分析

目的 探讨男性不育与Y染色体微缺失之间的关系.方法 利用6个Y染色体特异序列标签位点,以多重PCR技术对172例患者进行Y染色体AZF区域的微缺失筛查.结果 172例患者中共检出Y染色体微缺失7例,其中无精子症4例,少精子症3例,缺失率分别为15.38%和9.68%.正常生育组30例未发现Y染色体微缺失.结论 Y染色体微缺失筛查所用的标志物对于精子密度的减少可能是特异性的,Y染色体微缺失检测适用于临床上无精症和少精症的男性不育患者.     

Y染色体微缺失检测及进展

男性不育的病因很多,Y染色体微缺失是导致生精障碍的原因之一,其检测具有重要的意义。现从Y染色体微缺失的缺失率、检测意义、检测位点的选择及检测方法等几个方面进行综述。     

男性不育Y染色体微缺失的诊断及临床意义

目的 探讨男性不育Y染色体微缺失的诊断及临床意义。方法 提取患者精子中的DNA多重PCR扩增，对扩增物进行分析。结果 28例患者中共检出Y染色体微缺失3例，缺失率9．3％。结论 诊断Y染色体微缺失，找到不育的真正原因，从而避免不必要的药物及手术治疗，如一些激素的应用及精索静脉曲张的手术治疗，具有重要的临床意义。Y染色体微缺失基因与男性不育的研究及现状，为临床诊断、治疗男性不育症提供了依据。     

Y染色体微缺失及其检测方法

全世界大约有15％的夫妇不育,其中男性不育约占50％.Y染色体长臂上的AZF缺失是导致男性不育的重要因素.AZF进一步分为AZFa、AZFb和AZFc 3个区域,不同区域的微缺失引起不同程度的精子发生障碍.因此Y染色体微缺失的检测对男性不育的诊治有很重要的指导意义.目前Y染色体微缺失常用的检测方法有多重定性PCR法、实...     

威海地区男性不育患者Y染色体微缺失和染色体核型分析

目的:通过对威海地区男性不育患者Y染色体微缺失和染色体核型的分析,探讨遗传因素与男性不育之间的相关性,为患者的生育提供指导.方法:通过多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳的方法对来院就诊的302例男性不育患者及136例健康男性进行Y染色体微缺失检测,同时用G显带方法分析染色体核型.结果:302例患者中检出染色体异常11例,染色...     

324例男性不育患者Y染色体微缺失分析

目的探讨Y染色体微缺失与男性特发性不育及非特发性不育间的关系。方法利用染色体核型分析、PCR技术、血清内分泌激素及精浆果糖定量检查，对324例男性不育患者（特发性不育206例，非特发性不育118例）和60例正常生育男性进行研究。结果60例正常男性未检测出微缺失；206例特发性不育患者微缺失20例（20／206，9．71％）；21例染色体异常患者微缺失5例（5／21，23．81％）；91例精索静脉曲张患者微缺失10例（10／91，10．99％）；2例唯支持细胞综合症和4例高泌乳素血症患者未见缺失；35例微缺失患者精浆果糖不正常5例（5／35，14．29％），激素水平不正常27例（27／35，77．14％）。结论Y染色体微缺失是导致男性特发性不育及非特发性不育的重要原因。     

多重探针连接依赖式扩增快速检测染色体非整倍体异常

目的评价多重探针连接依赖式扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）在常见染色体非整倍体异常及其在产前诊断中的应用价值。方法收集经染色体核型分析证实的12例21三体、1例（45，X）、1例（47，XYY）患者，8名正常健康人外周血标本和4例21三体胎儿脐带血标本及1例21三体胎儿羊水、7例核型正常胎儿羊水，共计34份样本。提取外周血或脐带血基因组DNA，羊水标本蛋白酶K消化获得细胞裂解液，采用MLPA技术检测34份标本13、18、21、X和Y染色体拷贝数的变化。结果48h内即可完成样本分析。除1份离心后含大量红细胞的羊水标本经MLPA分析后提示（69，XXY）或母血污染外，其余33份外周血、脐带血或羊水标本报告均与染色体核型分析结果一致，临床符合率97．1％。正常二倍体标本Ratio值除Y染色体相对拷贝数变异略大外，其余均接近于1．0。经单因素方差分析，21三体和正常二倍体标本的Ratio均值间差异有统计学意义（F=298．906，P=0．000）。结论高灵敏度MLPA技术结合计算机辅助数据分析方法操作简便、快速、可自动化，是诊断常见染色体非整倍体异常的可靠方法。     

多重PCR技术在Y染色体微缺失快速筛查中的应用

目的探讨多重聚合酶链反应(PCR)技术在Y染色体微缺失快速筛查中的应用价值。方法以38例健康男性和46例无(少)精症男性外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,采用针对Y染色体无精子因子(AZF)4个亚区(AZFa～d)15个序列标签位点(STS)的多重引物进行PCR检测,并以琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果 84例受试者多重PCR检测成功率为100%,且特异性好,扩增效率高。健康男性标本可检出15个STS。患者中检出AZFc+d微缺失1例。结论多重PCR是快速筛查Y染色体微缺失的有效工具。     

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的 采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型.方法 采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定.提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型.对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析.结果 在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型.其中,127名为RHD基因缺失(占63.5％);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4) -D)及弱D15型(RHD845A)等位基因.在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711 delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G ＞T,385Gly＞ Val).结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测.也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源.     

多重连接探针扩增技术检测常见线粒体疾病

  目的  探讨多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)用于常见线粒体疾病基因检测的可行性。  方法  收集2010年5月至2012年8月北京协和医院281例可疑线粒体异常病例, 包括神经科存在神经系统损伤的患者233例及眼科疑诊Leber遗传性视神经病变的患者48例, 运用MLPA法对常见线粒体疾病突变位点进行检测, 并使用线粒体基因序列测定方法进行验证。  结果  281例标本中共38例检测到线粒体基因突变, 总检出率为13.5%。眼科48例标本中, 3460G > A、11778G > A和14484T > C 3种突变共检测到19例, 检出率为39.6%;神经科233例标本中, 3243A > G、8344A > G、8993T > G和大片段缺失共检测到19例, 检出率为8.2%。除1例大片段缺失暂无PCR测序验证外, 其余MLPA结果均经序列测定验证为相符。  结论  MLPA法是一种可行的快速、准确、简便的基因诊断方法, 可作为筛查常见线粒体疾病的检测工具, 为临床诊断和治疗提供依据。     

Y染色体微缺失检测及进展

男性不育的病因很多，Y染色体微缺失是导致生精障碍的原因之一，其检测具有重要的意义。现从Y染色体微缺失的缺失率、检测意义、检测位点的选择及检测方法等几个方面进行综述。