Axin通过激活p53的表达抑制结肠癌细胞的生长

目的： 观察过表达Axin对结肠癌SW480细胞生长的影响,并探讨其作用机制。方法：将pCMV5-HA-Axin质粒瞬时转染至结肠癌SW480细胞中,并设置转染空载体pCMV5-HA及未转染空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)比色法及克隆形成实验检测细胞增殖状态的变化,流式细胞仪检测细胞周期变化;RT-PCR检测Axin及p53 mRNA的表达;Western blot检测Axin及P53蛋白的表达。结果：与转染空载体及空白对照组比较,过表达Axin显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖。MTT实验显示转染Axin后细胞生长明显受到抑制,存活的瘤细胞明显减少(P<0.05);克隆形成实验结果显示瞬时转染Axin质粒组细胞集落形成能力明显下降(P<0.05);流式细胞仪分析检测结果显示转染Axin质粒后结肠癌SW480细胞周期G1前期比例升高,G1期明显被阻滞,S期比例下降(P均<0.05)。RT-PCR结果显示转染Axin的SW480细胞中p53 mRNA的表达较转染空载体组升高约1倍(P＜0.05);同时,Western blot结果显示转染质粒Axin后结肠癌SW480细胞中P53的蛋白表达量明显增加,较转染空载体组几近升高1倍(P＜0.05)。结论：过表达Axin抑制结肠癌SW480细胞增殖,其作用机制是通过激活癌基因p53的表达而发挥效应的。     

艰难梭菌毒素A诱导结肠癌SW480细胞线粒体凋亡途径的研究

目的:探讨艰难梭菌毒素A（Tcd A）对结肠癌细胞株SW480增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法:采用四唑蓝比色法（MTT）检测Tcd A对SW480细胞增殖的影响;流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡情况和线粒体膜电位的变化;PI细胞荧光双染色法观察细胞凋亡的形态学变化。结果:Tcd A能显著抑制SW480细胞的增殖,且抑制率呈浓度依赖性;流式细胞仪分析处理组SW480细胞出现明显的凋亡以及线粒体膜电位的降低;细胞荧光染色观察到典型的凋亡形态学变化。结论:Tcd A可诱导SW480细胞发生凋亡,其机制可能是通过诱导线粒体膜电位的下降,破坏其外膜结构而诱发的。     

pEGFC1-IGFBP7诱导恶性黑素瘤SK-MEL-28 细胞的凋亡

目的：构建胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7,IGFBP7）表达质粒(pEGFC1-IGFBP7),研究IGFBP7对恶性黑素瘤细胞SK-MEL-28凋亡的影响。方法：构建pEGFC1-IGFBP7质粒,并将pEGFC1-IGFBP7质粒及空质粒分别转染入SK-MEL-28细胞,荧光显微镜观测细胞转染效率,Annexin-FITC/PI检测转染后SK-MEL-28细胞的凋亡。结果：成功构建pEGFC1IGFBP7质粒,用Effectene试剂能将pEGFC1IGFBP7质粒有效转染入SK-MEL-28细胞,转染效率达61%。流式细胞仪结果显示pEGFC1IGFBP7可明显促进SKMEL28细胞凋亡,转染24 h后的凋亡率达（28.4±257）%,转染空质粒及未转染组细胞凋亡率分别为（5.8±0.44）%和（6.4±0.71）%（F=406.138,P<0.05）。结论：pEGFC1-IGFBP7能有效诱导黑素瘤SK-MEL-28细胞凋亡,为IGFBP7为基础的黑素瘤基因治疗提供了实验依据。     

生存素siRNA对结肠癌细胞凋亡增殖和侵袭性的影响

目的研究siRNA表达质粒沉默Survivin基因的效率及其对大肠癌细胞株SW480凋亡、增殖和侵袭性的影响.方法构建Survivin基因的siRNA表达质粒(pRNAT/sur-siRNA),用Westeron-blot和半定量RT-PCR研究该表达质粒转染SW480后Survivin蛋白和mRNA表达的变化,流式细胞仪检测Survivin基因沉默后SW480细胞凋亡的变化,MTT法检测SW480细胞体外增值的变化细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化.结果针对Survivin的siRNA的表达质粒下调大肠癌SW480细胞株Survivin蛋白和mRNA的表达水平,分别为85.0%,80.0%;pRNAT/sur-siRNA转染SW480后,SW480细胞凋亡率为16.9%;细胞增殖抑制率为37.4%,与对照组相比有显著差异(P＜0.01);细胞侵袭实验示pRNAT/sur-siRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480、SW480细胞的细胞穿透数分别为153±66、505±65、578±98个,(P＜0.01).结论针对Siurvivin的siRNA可以显著降低Survivin的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,促进肿瘤细胞的凋亡.     

生存素siRNA表达质粒对结肠癌细胞侵袭和增殖能力的抑制作用

 目的 构建针对生存素的小分子RNA干扰表达质粒，研究siRNA表达质粒沉默生存素基因后对大肠癌细胞株SW480侵袭性和增殖性的影响。方法 用pRNAT U6.1/Neo载体构建生存素 siRNA表达质粒（pRNAT/sur siRNA），该质粒转染SW480细胞株48小时后，用Westeron blot和半定量 RT PCR分析生存素蛋白和mRNA表达的变化。G418 400μg/L筛选阳性克隆细胞株（sur siRNA/SW480），MTT法检测SW480细胞体外增殖的变化；细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化。结果 成功地构建了pRNAT/sur siRNA表达质粒，并且该质粒明显下调SW480细胞生存素蛋白和mRNA的表达水平，分别下调85%，80%。G418 400μg/L筛选出转染pRNAT/sur siRNA的SW480细胞株（sur siRNA/SW480）；sur siRNA/SW480细胞增殖受到显著抑制，抑制率为37.4% (P<0.01)；细胞侵袭实验示sur siRNA/SW480细胞的穿透数为(153±66)个，而对照组pRNAT/SW480、SW480细胞的穿透数为(505±65)，(578±98)个细胞，sur siRNA/SW480细胞的穿透数与对照组相比显著减少(P<0.01)。结论 针对生存素siRNA可以显著降低生存素的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，该生存素siRNA序列可能成为治疗结肠癌的一种有效手段。     

干扰素诱导跨膜蛋白1协同干扰素抑制结肠癌细胞增殖

目的：研究干扰素诱导跨膜蛋白1(interferon induced transmembrane protein 1,IFITM1)协同干扰素对结肠癌细胞株SW480增殖的影响。方法：将IFITM1基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3,IFITM1/pEGFP-C3重组质粒转染结肠癌细胞株SW480,G418 500mg/L筛选阳性克隆细胞。激光共聚焦显微镜及RT-PCR检测IFITM1的表达。实验设pEGFP- C3/SW 480组、IFITM1/SW 480组、IFITM1/anti-IFITM1/SW 480、空白组,除空白组外,每组加入IFN_(-α) 1000 U/mL。MTT检测细胞的增殖性。结果：IFITM1/pEGFP-C3重组质粒转染SW480细胞后,激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光融合蛋白位于细胞膜周围,RT-PCR在IFITM1/SW 480细胞中检测到IFITM1 mRNA表达,SW 480细胞及pEGFP-C3/SW480细胞中未见IFITM1 mRNA表达。MTT分析细胞增殖示pEGFP-C3/SW 480组、IFITM1/SW 480组、IFITM1/anti-IFITM1/SW 480组的D_(570mm)处值分别0.745±0.0267、0.346±0.0316、0.696±0.0613,空白组的D_(570mm)值是0.835±0.0362,IFITM1/SW 480细胞增殖比pEGFP-C3/SW 480细胞及IFITM1/anti-IFITM1/SW 480细胞低(P＜0.05)。而pEGFP-C3/SW 480细胞的增殖与IFITM1/anti-IFITM1/SW 480细胞增殖相比无显著差异(P＞0.05)。结论：IFITM1可协同IFN-α抑制SW 480细胞体外增殖。     

基因对胃癌MGC 803细胞的抑制作用及其可能的机制

目的:研究沉默乳腺癌相关抗原1（breast cancerassociated antigen 1,BRCAA1)基因对胃癌细胞株MGC803的抑制作用及其可能的机制。方法：构建BRCAA1基因shRNA载体，将构建的shRNABRCAA1质粒与阴性对照质粒shRNAN转染胃癌MGC803细胞，24 h后用荧光显微镜观察转染效率，实时定量PCR检测 BRCAA1和GAPDH基因mRNA表达水平。MTT法检测转染后24、48与72 h的细胞增殖水平，AnnxinV PE/7AAD检测转染24 h后的细胞凋亡水平，Western blotting检测转染48 h后细胞的凋亡相关蛋白表达水平。结果：BRCAA1 siRNA表达质粒转染MGC803细胞24 h 的转染效率为（81.2±2.6）％ 。转染后48 h MGC803细胞的BRCAA1 mRNA水平下降了61.4％，MGC803细胞增殖的抑制率达45.0%，转染siRNA细胞的凋亡率明显高于未转染细胞和对照质粒转染细胞\[（14.4±１.6）% vs（5.4±2.0）％，（4.4±2.5）％，P<0.05\]。转染siRNA细胞的凋亡相关蛋白Rb与Bax的表达量显著增加（P<0.05），Bcl2的表达量显著减少（P<0.05）。结论：BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌MGC803细胞的增殖和诱导细胞凋亡，其机制与其促进Rb和Bax蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达有关。     

c-myc反义寡核苷酸对表达FHIT基因的结肠癌细胞增殖及凋亡作用的影响

目的：观察脂质体介导的c—myc反义寡核苷酸对表达FHIT基因的结肠癌细胞增殖及凋亡作用的影响。方法：用脂质体法将重组FHIT基因的PRC／CMV质粒和空载体质转染到人结肠细胞株SW480，随后分别转染c—myc反义寡核苷酸。Western blot法检测细胞FHIT和c—myc的表达；MTF法检测细胞的增殖；AO／EB染色法和流式细胞分析技术检测细胞的凋亡。结果：转染FHIT基因后，SW480细胞有明显的FHIT蛋白表达而转染空载体的细胞未检测到FHIT蛋白表达。C—myc反义寡核苷酸转染后，对SW480细胞c—myc的表达有明显的抑制作用（P〈0．01）；对FHIT＋／-SW480细胞的增殖均有明显的抑制作用（P〈0．01），且对FHIT＋SW480细胞的抑制作用明显强于FHIT—SW480细胞（P〈0．05）。同时，c-myc反义寡核苷酸对FHIT＋／-SW480细胞的凋亡均有明显的促进作用，对FHIT＋SW480细胞凋亡的促进作用明显强于FHIT—SW480细胞（P〈0．05）。结论：FHIT基因的表达和癌基因c—myc的表达抑制共同作用可以发挥较强的抗肿瘤细胞的效果，为多基因联合干预治疗肿瘤奠定了理论基础。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因对肝癌细胞SK-Hep-1黏附和侵袭的影响

摘 要 目的: 肝细胞癌中高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因(glypican3,GPC3)，而在非肿瘤肝组织、肝细胞腺瘤、胆管癌、肝内胆管细胞癌、胆囊癌等细胞中低表达甚至不表达；本研究利用携带GPC3重组真核表达载体，探讨GPC3基因对SKHep1肝癌细胞增殖、黏附和侵袭能力的影响。方法：将pEGFP-N2-GPC3通过脂质体方法转染人肝癌细胞SKHep1。RT-PCR检测GPC3SKHep1细胞中GPC3 mRNA的表达；MTT法检测SK-Hep-1细胞的增殖并计算黏附率；Transwell小室实验检测SK-Hep-1肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。结果：pEGFPN2GPC3成功转染SKHep1细胞，转染后GPC3-Hep-1细胞明显表达GPC3mRNA。GPC3转染能显著抑制肝癌细胞SK-Hep-1的增殖（P<0.01）；GPC3转染细胞的黏附能力较对照细胞显著下降[（10.21±0.62）% vs (15.51±095)%,P<0.01];GPC3转染细胞的迁徙和侵袭能力较对照细胞明显增强[（131.7±7.44）vs（69.6±5.25），P<0.01;(220±12.8) vs （130±8.2），P< 0.01]。结论：GPC3基因显著抑制肝癌细胞的增殖和黏附能力，但显著增强后者的迁移和侵袭能力。     

忍冬藤提取物抗结肠癌作用研究

【摘要】目的研究忍冬藤提取物的体外抗结肠癌作用。方法体外培养结肠癌HCT116和SW480细胞并用忍冬藤提取物干预,采用CCK8法检测忍冬藤提取物对HCT116和SW480细胞增殖的影响;采用Hochest法和Annexin V/PI法检测忍冬藤提取物及p53抑制剂PFT α对HCT116和SW480细胞凋亡的影响;JC 1法检测忍冬藤提取物对HCT116细胞线粒体膜电位的影响;Western Blot检测忍冬藤提取物对HCT116细胞相关蛋白表达水平的影响。结果相较于空白组,忍冬藤提取物可明显抑制结肠癌HCT116和SW480细胞增殖,并促进细胞凋亡（P<001）,促进HCT116细胞线粒体膜电位坍塌,明显上调HCT116细胞Bax/Bcl 2的比值（P<001）以及Cleaved PARP、Cyt C、Cleaved Caspase 3和p53蛋白表达（P<005,P<001）;相较于忍冬藤提取物组,忍冬藤提取物+PFT α明显抑制HCT116细胞凋亡（P<001）。结论忍冬藤提取物可通过诱导p53依赖的线粒体凋亡发挥抗结肠癌作用。     

GRIM-19的表达对人宫颈癌细胞移植瘤生长的影响

目的 探讨GRIM-19对宫颈癌细胞株HeLa增殖行为的影响及其机制。方法采用RT-PCR和Western blot检测基因的mRNA和蛋白水平表达情况。将HeLa/control、HeLa/GRIM 19接种到裸鼠皮下检测荷瘤情况,利用免疫组织化学法检测Ki-67的表达。结果HeLa/ GRIM-19细胞接种肿瘤生长速度明显减慢(P<0.01)。移植瘤的RT-PCR结果：GRIM-19表达升高、而其下游基因STAT3、Cyclin B1、Bcl-L2的表达降低;蛋白检测发现STAT3、p-STAT3、suvivin 、Ki-67基因的表达均下降,GRIM-19表达升高。结论 GRIM-19的表达可以抑制宫颈癌细胞的增殖,可能是宫颈癌治疗的新靶点。     

Decreased expression of GRIM-19 by DNA hypermethylation promotes aerobic glycolysis and cell proliferation in head and neck squamous cell carcinoma

To identify novel tumor suppressor genes that are down-regulated by promoter hypermethylation in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), genome-wide methylation profiling was performed using a methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) array in HNSCC and normal mucosa tissue samples. Promoter hypermethylation of the candidate gene, gene associated with retinoid-interferon induced mortality-19 (GRIM-19), was confirmed in HNSCC cell lines. Multivariate regression analysis determined that GRIM-19 hypermethylation was an independent significant factor for HNSCC diagnosis (OR:125.562; P < 0.001). HNSCC patients with lower ratio of GRIM-19/ACTB hypermethylation had increased overall and disease free survival. Furthermore, the optimal cutoff provided 90% sensitivity and 77% specificity of GRIM-19 hypermethylation as a diagnostic marker for HNSCC. Ectopic expression of GRIM-19 in HNSCC cells led to increased oxygen consumption, reduced glycolysis and decreased cell proliferation. HNSCC cells ectopically expressing GRIM-19 displayed increased p53 activity as well as decreased Stat3 and HIF-1α activities. Moreover, GRIM-19 knockdown not only resulted in decreased oxygen consumption and increased aerobic glycolysis but also promoted cell proliferation and tumorigenic capacity in HNSCC cells. Our data indicate that decreased GRIM-19 expression due to promoter hypermethylation may be important in head and neck carcinogenesis by promoting cell proliferation and regulating metabolic activity.     

GRIM-19和STAT3在皮肤鳞癌组织中的表达及相关性研究

目的:研究干扰素联合维甲酸诱导的细胞凋亡相关基因-19（GRIM-19）和信号传导和转录激活子3（STAT3）在皮肤鳞癌中的表达水平及二者在不同分化组织中的变化和相互关系。方法:选取37例分化程度不同的皮肤鳞癌组织及20例正常组织,采用免疫组化法检测其中GRIM-19和STAT3的表达。结果:正常皮肤组织中GRIM-19蛋白为棕黄色颗粒,皮肤鳞癌组织中GRIM-19蛋白表达较正常明显偏低,STAT3蛋白在皮肤鳞癌组织中表现为棕褐色颗粒,正常皮肤组织中STAT3蛋白表达明显减弱,差异均有统计学意义（P＜0.05）;GRIM-19在不同分化皮肤鳞癌中表达不同,随着肿瘤分化程度下降,GRIM-19表达下降,STAT3在不同分化皮肤鳞癌中表达不同,随着肿瘤分化程度增高,STAT3表达增强,差异及相关性均有统计学意义（P＜0.05）;GRIM-19表达趋向降低时,STAT3表达趋向增高,二者呈负相关（P＜0.05）。结论:GRIM-19在皮肤鳞癌中表达下调,而STAT3的表达增高,二者的表达水平与组织的分化程度相关,且二者间为负相关,GRIM-19可能通过对STAT3的负向调节,在皮肤鳞癌中发挥抑制作用,将可成为治疗皮肤鳞癌的新思路。     

GRIM-19在Bowen病和皮肤鳞状细胞癌组织中的表达

目的:通过研究GRIM-19在Bowen病和皮肤鳞癌皮损中的表达水平,来探讨GRIM-19在皮肤鳞癌中的发生、发展作用。方法:采用免疫组化法检测Bowen病和皮肤鳞癌皮损和正常皮肤中GRIM-19的表达。结果:正常皮肤组织中GRIM-19蛋白在表皮全层的细胞质中明显表达（7.8±3.1）;在Bowen病中,GRIM-19蛋白少量表达于细胞质中,较正常皮肤组织表达明显减弱（3.2±2.8）;在鳞癌组织中GRIM-19蛋白表达最弱（0.8±2.2）。两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);三者间比较,差异也有统计学意义(P＜0.05)。结论:GRIM-19蛋白的减少可能在皮肤鳞癌的发生与发展过程中发挥重要作用。     

GRIM-19蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

背景与目的：维甲酸／干扰素联合应用诱导细胞凋亡相关的基因（gene ssociated ith etinoid-rnterferon—induced mortality-19．GRIM-19）是死亡相关基因中的一员．它的过高表达可以抑制肿瘤细胞的增殖。促进细胞的凋亡。本研究检测非小细胞肺癌和正常肺组织中GRIM-19蛋白的表达和定位,探讨其在非小细胞肺癌组织中表达的临床意义。方法：应用免疫组化ABC法检测49例非小细胞肺癌组织及相应癌旁正常组织中GRIM-19蛋白的表达情况,并用光密度（A）值定量描述其表达水平：同时用激光共聚焦扫描技术检测GRIM-19蛋白在细胞内的定位。结果：正常肺组织中GRIM-19主要定位于细胞浆中;而肿瘤组织主要位于细胞核中。激光共聚焦扫描技术检测验证了这种结果。GRIM-19蛋白在正常肺组织中阳性率为93．8％（46／49）,而在非小细胞肺癌中阳性率为55．1％（27／49）,两者之间的差异有统计学意义（P〈0．01）。肿瘤组织中GRIM-19蛋白的平均表达水平（A值为0．22±0．01）比正常组织（A值为0．29±0．02）下降24．3％（P〈0．01）。GRIM-19蛋白阳性率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ＋Ⅳ期非小细胞肺癌组织中分别是78．6％、48．1％、12．5％,其差异有统计学意义（rs=-0．428,P〈0．05）。结论：肺癌组织中GRIM-19蛋白表达随肿瘤恶性程度升高而显著下降甚至缺失,分布由胞浆转入细胞核;GRIM-19蛋白表达可能与肺癌的发生发展相关。     

细丝蛋白A抑制荷人结肠腺癌细胞SW480裸鼠移植瘤的生长

目的:探讨细丝蛋白A(fi lamin A,FLNa)基因对人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内成瘤的影响及其可能的机制。方法:将重组载体质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa通过脂质体介导的方式转染到SW480细胞中,RT-PCR和蛋白质印迹法检测SW480/FLNa细胞中FLNa mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞的体外增殖能力。将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长情况,计算抑瘤率,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,RT-PCR和蛋白质印迹法检测移植瘤组织中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)mRNA和蛋白的表达水平。结果:FLNa基因在SW480细胞中获得稳定表达,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞的体外增殖能力相似;SW480/FLNa组移植瘤的生长速度和质量低于SW480组,抑瘤率为(88.7±3.5)%(P=0.000);SW480/FLNa组移植瘤组织出现退变坏死,MMP-9mRNA和蛋白的表达水平(0.11±0.02和0.02±0.00)均低于SW480组(1.12±0.02和1.25±0.05),差异均有统计学意义(P=0.012,P=0.025)。结论:FLNa基因具有抑制人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内的生长作用,其作用机制可能与下调MMP-9的表达有关。