四妙勇安汤含药血清对LPS诱导的M1/M2巨噬细胞极化及NF-κB/NLRP3通路的影响

目的 探讨四妙勇安汤含药血清对LPS刺激的M1/M2巨噬细胞极化及NF-κB/NLRP3通路的影响。方法 SD大鼠分别给予四妙勇安汤水煎液、生理盐水灌胃制备含药血清及正常对照血清。细胞分组为正常对照组、模型组、四妙勇安汤组、JSH-23组,除正常对照组外,其余组均用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞。CCK8法检测细胞活性;ELISA检测细胞上清IL-4、IL-18水平;qRT-PCR法检测细胞i NOS、CD197、CD206、NLRP3 mRNA表达;免疫荧光标记测i NOS、CD197、CD206、NF-κB表达;Western blot检测NF-κB磷酸化、NLRP3炎症小体蛋白表达。结果 CCK8显示30%浓度以下的含药血清干预LPS诱导的巨噬细胞OD值无明显变化（P>0.05）。与正常对照组比较,模型组细胞iNOS、CD197、IL-18、NF-κB、NLRP3表达升高,CD206、IL-4表达降低（P<0.01）。与模型组比较,四妙勇安汤组及NF-κB抑制剂JSH-23组细胞iNOS、CD197、IL-18、NF-κB、NLRP3表达降低,CD206、IL-4...     

沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡

目的 探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡的作用及其机制.方法 用60 mg/L的ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化,记为ox-LDL组,不添加ox-LDL的作为对照(NC)组;将si-con和si-CXCL12转染至RAW2...     

荷叶碱通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬减少巨噬细胞泡沫化的机制研究

目的:探讨荷叶碱对泡沫细胞形成的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养人单核-巨噬细胞系THP-1,利用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导建立泡沫细胞模型,同时用5、10和20μmol/L荷叶碱进行干预。采用油红O染色观察细胞内脂质沉积;用试剂盒测定细胞总胆固醇含量;通过Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白水平,免疫荧光检测自噬流,透射电镜检测自噬小体,评估细胞内自噬水平及自噬相关通路的变化。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬,观察荷叶碱是否通过调控自噬抑制泡沫细胞形成。结果:与正常对照组相比,Ox-LDL组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著增加。与Ox-LDL组相比,荷叶碱组细胞内脂质沉积和总胆固醇含量显著减少,自噬流显著增强,自噬小体增多;3-MA处理后,荷叶碱抑制细胞泡沫化的作用被削弱。荷叶碱降低p-mTOR和p-Akt蛋白水平。结论:荷叶碱可能通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路促进自噬,减少细胞内脂质沉积,从而抑制泡沫细...     

黄连解毒汤含药血清对巨噬细胞自噬相关基因表达的影响

目的:考察黄连解毒汤含药血清对RAW264郾7 巨噬细胞自噬的影响,初步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法:采用大、中、小剂量黄连解毒汤水煎剂灌胃干预SD 大鼠,制备含药血清;经MTT 法观察含药血清对细胞增殖的影响后,选择各剂量浓度为20% 的含药血清干预体外培养的巨噬细胞,采用荧光定量PCR 方法检测自噬相关基因Beclin1 和mTOR 的mRNA 表达水平;Western blot 检测Beclin1、p鄄mTOR 蛋白的表达变化。结果:与正常对照组血清相比,黄连解毒汤含药血清干预后诱导了Beclin1 mRNA 及蛋白的表达,抑制了mTOR mRNA 及p鄄mTOR 蛋白的表达。结论:黄连解毒汤含药血清可诱导RAW264郾7 巨噬细胞自噬相关基因Beclin1 的表达、抑制mTOR 的表达,这可能是该方抗动脉粥样硬化作用的重要机制之一。     

连翘苷对感染性休克小鼠急性肺损伤的作用与机制

目的 探讨连翘苷通过腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)/p70核糖体S6蛋白激酶(p70 S6 kinase,p70S6K)信号通路介导的自噬对感染性休克小鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的影响。方法 随机选择12只小鼠作为对照组,其余小鼠通过腹腔注射20 mg·kg^-1脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建感染性休克小鼠模型,将感染性休克小鼠随机平分为模型组、低、中、高剂量实验组(5 mg·kg^-1、10 mg·kg^-1、20 mg·kg^-1连翘苷)、高剂量+抑制剂组(20 mg·kg^-1连翘苷+20 mg·kg^-1AMPK抑制剂compound C),每组均12只小鼠。称量肺干重及湿重,计算W/D比值;ELISA法检测...     

PI3K/Akt/mTOR信号通路在巨噬细胞自噬及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用

 目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在巨噬细胞自体吞噬以及动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用。方法：利用Akt抑制剂康士得（20 μmol/L）、mTOR抑制剂雷帕霉素（10 nmol/L）及mTOR-siRNA（30 nmol/L）体外处理小鼠RAW 264.7 巨噬细胞株 48 h后,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量qRT-PCR和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测巨噬细胞分泌炎症因子水平。体内实验中, 24只雄性新西兰兔给予球囊损伤+ 1%胆固醇喂养8周,然后随机分为对照组、康士得（1.0 mg·kg-1·d-1）组和雷帕霉素（0.5 mg·kg-1·d-1）组,每组8只,干预4周。血管内超声（IVUS）检测斑块的影像学特征,透射电镜观察斑块中巨噬细胞超微结构的改变,免疫荧光法检测微管相关蛋白LC3-II表达,免疫组织化学法检测巨噬细胞Akt和mTOR的蛋白表达。 结果：与对照组比较,康士得、雷帕霉素及mTOR-siRNA干预巨噬细胞后,透射电镜下观察到自噬体明显增多,微管相关蛋白LC3-II和自噬相关蛋白Beclin 1的表达水平明显上调,而Akt及mTOR 的mRNA及蛋白表达水平明显减少,巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而IFN-γ的分泌显著增加。体内实验： IVUS显示,与对照组比较,康士得组及雷帕霉素组的外弹性膜面积（EEMA）、斑块面积（PA）及斑块负荷（PB）明显减少,透射电镜下观察到巨噬细胞中自噬体增加,组织免疫荧光法示LC3-II明显增加,HE染色显示斑块纤维帽的厚度明显增加,内、中膜厚度显著减低,组织免疫组化染色显示巨噬细胞RAM-11及p-mTOR染色显著减少。结论：选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能诱导巨噬细胞自噬,减少斑块巨噬细胞的浸润, 抑制炎症反应进而稳定动脉粥样硬化易损斑块。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。     

NVP-BEZ235诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬的机制研究

 目的:探讨PI3K/Akt/mTOR双靶点抑制剂NVP-BEZ235诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞自噬的作用。方法:免疫组化法检测p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中的水平。WST-1比色法检测NVP-BEZ235对胆管细胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法检测NVP-BEZ235对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及自噬标志蛋白LC3和Beclin 1的变化。结果:p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠胆管上皮细胞中显著升高,NVP-BEZ235可明显抑制胆管上皮细胞的活力,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);NVP-BEZ235明显抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的水平;并上调自噬标志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表达水平。LC3、Beclin 1基因沉默和3-MA均可明显减弱NVP-BEZ235对细胞活力的抑制作用(P<0.01)。结论:NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的活力,其机制与自噬密切相关。     

有氧耐力运动调控大鼠心肌细胞自噬的机制

背景：近年来,衰老相关的慢性病研究在世界范围内受到广泛关注,心脏随着年龄增长可能会出现过早衰老,运动作为一种安全健康的干预措施可以延缓其衰老。目的：观察实施规律有氧运动对心肌细胞增龄性老化的影响并探讨其机制。方法：纳入SD大鼠68只,3月龄(青年)20只,13月龄(中年)和22月龄(老年)各24只,每个年龄组再随机均分为静息组及运动组。对3个运动组实施为期10周的递增负荷有氧跑台运动,其中早期递增负荷6周,晚期恒负荷4周;3个静息组不进行有氧运动干预。干预结束后采用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测心肌Beclin-1、Ca MKⅡα1、AMPKα1/p AMPKα1和PI3K/Akt/m TOR等通路相关蛋白与基因的表达。结果与结论：(1)实施规律有氧运动后,与青、中、老3个年龄的静息组相比,3个年龄的运动组大鼠心肌细胞自噬Beclin-1表达水平均下调;同时3个年龄的运动组大鼠心肌Ca MKⅡα1 m RNA表达水平也下调;(2)3个年龄静息组p AMPKα1和AMPKα1蛋白表达水平均呈现增龄性趋势;青年、中年和老年运动组的AMPKα1表达水平分别上调16.50%(Ρ<0....     

Knockdown of DSPP inhibits the migration and invasion of glioma cells

Dentin sialophosphoprotein (DSPP) is a member of the SIBLING (Small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins) family of phosphoglycoproteins and has been proved to contribute to the migration of a variety of solid tumor cells. However, whether DSPP participates in the pathogenic process of glioma remains unknown. In this study, we aimed to investigate the expression and biological function of DSPP in human glioma cells. We demonstrated through Western blot that DSPP is overexpressed in glioma tissues comparing to normal brain tissues. To investigate the role of DSPP in glioma carcinogenesis, we reduced the DSPP expression by small interfering RNA (siRNA) and found that DSPP silencing significantly inhibited the migration and invasion of glioma cells, the critical characteristics of glioma. Furthermore, we showed that DSPP down-regulation significantly decreased the activation of the AKT/mTOR/p70S6K pathway in glioma cells. Taken together, these findings indicate that knockdown of DSPP inhibits glioma cells migration and invasion, suggesting that targeting DSPP might be a potentially effective therapeutic strategy for treating glioma.     

mTOR_P70S6K信号通路在小儿脑胶质瘤中的表达及其临床意义

目的:探讨mTOR_P70S6K信号通路在小儿脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法:随机选取脑胶质瘤患儿88例,采用SP免疫组化方法,检测脑胶质瘤组织和正常脑组织中mTOR蛋白及P70S6K蛋白的表达。并分析其与脑胶质瘤组织临床分级之间的关系。结果:mTOR蛋白及P70S6K蛋白在脑胶质瘤组织中的阳性表达率分别为81.58%(31/38)和78.95%(30/38),明显高于其在正常脑组织中的阳性表达率[分别为15%(3/20)和10%(2/20)](P<0.01)。mTOR蛋白和P70S6K蛋白在脑胶质瘤组织中的表达呈正相关(r=0.68,P<0.05),且两者在正常脑组织中的表达亦正相关性(r=0.89,P<0.01)mTOR蛋白及P70S6K蛋白阳性表达率在脑胶质瘤高级别组(Ⅲ~Ⅳ级)中的表达均明显高于低级别组(Ⅰ~Ⅱ级),说明随着肿瘤级别的升高二者的表达也增强。结论:mTOR_P70S6K信号通路在小儿脑胶质瘤中发生了特异性的激活。该通路可能与小儿脑胶质瘤的发生、发展密切相关。     

过氧化物酶体增生物激活受体激活物对ox-LDL诱导内皮细胞c-fos表达的影响

目的 观察过氧化物酶体增生物激活受体α激活物K877对氧化型低密度脂蛋白所诱导的人脐静脉内皮细胞c-fos基因表达的影响及机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,采取氧化型低密度脂蛋白刺激,应用K877干预,逆转录聚合酶链反应检测c-fos基因的表达。结果 与对照组比较,氧化型低密度脂蛋白组c-fos基因表达增加（P＜0.05）;与氧化型低密度脂蛋白组比较,K877组c-fos基因表达减少（P＜0.05）;与K877组比较,K877联合多聚肌甘酸c-fos基因表达进一步下降（P＜0.05）。结论 氧化低密度脂蛋白促进了人脐静脉内皮细胞c-fos基因的表达,过氧化物酶体增生物激活受体α激活物K877可抑制c-fos基因的表达,血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1参与了该过程。     

PI3K/AKT信号通路在SjCystatin诱导M2巨噬细胞分化过程中的影响

目的:进一步确定日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Sj Cystatin)诱导M2巨噬细胞分化的亚型及相关机制。方法:用ELISA、RT-q PCR或Western blot法测定IL-10、IL-12、巨噬细胞亚型表面标志物LIGHT(M2b)及Arg-1(M2a+M2c)的表达;用Western blot法测定AKT的磷酸化水平。结果:Sj Cystatin处理组在6 h、12 h和24h时IL-10表达量持续增加;处理12 h,LIGHT的mRNA和蛋白表达量增加但Arg-1的mRNA和蛋白表达量降低;AKT磷酸化水平增加。PI3K/AKT抑制剂处理组IL-10的释放量在12 h和24 h持续降低;24 h,LIGHT的mRNA和蛋白表达量降低但Arg-1的mRNA和蛋白表达量增加;AKT的磷酸化水平减少。结论:Sj Cystatin促进了活化的M2巨噬细胞分化为M2b亚型巨噬细胞,并且PI3K/AKT信号通路参与了这一过程。     

胰升糖素样肽1对肥胖大鼠肝脏组织中Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的干预效应

目的:研究胰升糖素样肽1受体激动剂利拉鲁肽对肥胖大鼠肝脏组织Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为正常饮食组(NC组)与高脂饮食组(HF组),喂养12周后,每组取5只评估肥胖大鼠模型建立。HF组再随机分为HF组、低剂量利拉鲁肽组(LG组)、中剂量利拉鲁肽组(MG组)与高剂量利拉鲁肽组(HG组),各组分别给予生理盐水及不同剂量利拉鲁肽(50、100和200μg/kg,皮下注射,每天2次) 4周。16周时测定体重及附睾脂肪指数;取大鼠肝脏组织HE染色观察肝脏脂肪变性情况; Western blot法检测肝脏组织中Sesn2、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白水平。结果:HF组大鼠的体重明显高于NC组(P 0. 01)。HF组肝脏细胞出现脂肪变性。与NC组相比,HF组的Sesn2蛋白水平明显降低(P 0. 01),p-AMPK/AMPK水平明显降低(P 0. 01),而p-mTOR/mTOR水平与NC组相比差异没有统计学显著性。利拉鲁肽干预4周后,药物处理组大鼠体重明显低于HF组(P 0. 01),MG与HG组大鼠的附睾脂肪指数较HF组降低(P 0. 01),肝组织脂肪变性较HF组减轻; HG组的Sesn2蛋白水平明显高于HF组(P 0. 01),MG与HG组的p-AMPK/AMPK水平较HF组明显升高(P 0. 01),LG组、MG与HG组p-mTOR/mTOR水平较HF组明显降低(P 0. 01)。结论:胰升糖素样肽1受体激动剂可能通过Sesn2/AMPK/mTOR信号通路影响机体能量代谢,改善肥胖状态。     

mTOR/P70S6K/HIF-1α信号通路在脂多糖诱导Caco-2细胞屏障损伤中的作用及机制

目的:探讨缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Caco-2细胞屏障损伤中的作用,并探究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)/P70核糖体蛋...     

槲皮素对ox-LDL所致的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响

 目的：研究槲皮素(quercetin,QUE)预处理对氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)所致小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响,并探讨可能的分子机制。方法：体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,给予20、40和80 μmol/L QUE预处理30 min,再加入ox-LDL (100 mg/L)继续培养24 h。采用油红O染色检测细胞内脂质蓄积,测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以评价细胞膜完整性和脂质过氧化程度。分别采用real-time PCR和免疫印迹技术检测清道夫受体CD36 mRNA和蛋白表达变化。结果：QUE (20,40和80 μmol/L)预处理显著抑制ox-LDL所诱导的巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞形成,且呈浓度依赖性。ox-LDL组细胞LDH释放增加,而QUE预处理则显著抑制ox-LDL的上述细胞毒性。与ox-LDL组比较,QUE预处理组细胞内ROS含量和培养液中MDA水平明显降低。另外QUE预处理在mRNA和蛋白水平均明显抑制ox-LDL所诱导的CD36表达上调。结论: QUE可减轻ox-LDL所诱导的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化,其机制可能部分是通过下调CD36表达实现的。     

黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后细胞自噬和PI3K信号通路的影响

目的:探讨黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的细胞自噬的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,观察黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对细胞自噬的影响,并通过PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路研究黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍的作用机制。结果:氧糖剥夺2 h复糖复氧24 h后,PC12细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黄芪甲苷、人参皂苷Rg1及黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍均能下调OGD/R后PC12细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,且配伍组的效应强于药物单用组。机制研究表明,人参皂苷Rg1单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍能升高PI3KⅠ、Akt、m TOR蛋白磷酸化水平,配伍的效应强于药物单用;黄芪甲苷单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍均能抑制PI3KⅢ、beclin-1蛋白表达,而配伍还能上调Bcl-2蛋白表达,且配伍的效应强于药物单用组。结论:PC12细胞在缺糖缺氧2 h再复糖复氧24 h后,细胞出现自噬;黄芪甲苷和人参皂苷Rg1均能减轻OGD/R诱导的PC12细胞自噬,且2者配伍对细胞自噬具有协同抑制作用,其机制可能与调节PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路有关。     

LOX-1介导ox-LDL诱导的血管内皮细胞MCP-1的表达

目的：观察血凝素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）对氧化LDL（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞(human unbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）基因及蛋白的影响。 方法： 用RT-PCR和Western blot的方法观察ox-LDL对培养的HUVECs表达LOX-1和MCP-1基因及蛋白的影响，然后用LOX-1的受体阻滞剂爱兰苔胶（carrageenan） 和聚肌苷酸［polyinosinic acid，poly(I)］与HUVECs预先作用后，再观察内皮细胞表达LOX-1和MCP-1基因和蛋白的变化。 结果： 用不同浓度的ox-LDL（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 、50 mg/L、100 mg/L）与HUVECs培养24 h后，LOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显增加，呈浓度依赖性；用Carrageenan 和polyinosinic acid与HUVECs预先作用2 h后，再加入50 mg/L的ox-LDL培养24 h，与未加Carrageenan和polyinosinic acid相比，HUVECsLOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显减少。 结论： ox-LDL可以调节培养的HUVECsLOX-1和MCP-1基因和蛋白的表达，LOX-1作为ox-LDL的特异性受体，可能介导了ox-LDL诱导血管内皮细胞分泌MCP-1，从而在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。