NGAL基因3''''端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的将不同长度的NGAL基因3'端序列(包括外显子、内含子和部分3'侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素酶活力,确认NGAL 3'端序列中是否含有增强子或抑制子元件.方法应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1 880 bp)和F7(826 bp),将其克隆到pGEM-T easy载体,并测序验证;再亚克隆到pGL3-Promoter载体中,获得pGLP-F5和pGLP-F7表达载体;将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件.结果我们成功构建了pGLP-F5和pGLP-F7重组载体.Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比,酶活力未表现出明显的增强或减弱.结论在本研究的实验条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不明显.     

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的:将不同长度的NGAL基因 3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧 翼非翻译序列)克隆到pGL3 Promote (pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素 酶活力,确认NGAL3′端序列中是否含有增 强子或抑制子元件。方法:应用PCR技术 从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同 长度的NGAL基因片段F5(1880bp)和F (826bp),将其克隆到pGEM Teasy载体 并测序验证;再亚克隆到pGL3 Promoter载 体中,获得pGLP F5和pGLP F7表达载体 将pGLP F5和pGLP F7载体分别与pRL TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞 通过检测相对荧光素酶活力,确认这些 NGAL基因片段中是否含有增强子元件 结果:我们成功构建了pGLP F5和pGLP F 重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞 与pGL3 Promoter相比,酶活力未表现出明 显的增强或减弱。结论:在本研究的实验 条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的 顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不 明显。     

NGAL 基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

 目的 对NGAL(neutrophil gelatimse-associated lipocalin)基因5’侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定。方法 将NGAL基因5’侧翼区-416～+84和-152～+84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中，构建表达载体pGLE-416和pGLE-152；然后将pGLE-152和pGLE-416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件。结果 与pGLE相比，pGLE-152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0．05)，且在不同的细胞中增强的幅度明显不同。结论 NGAL基因的启动子位于-152～+84区段内，启动子的强弱具有细胞特异性，这可能与增强子的协同作用相关联。     

NGAL 基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

目的对NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因5′侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定.方法将NGAL基因5'侧翼区-416～ 84和-152～ 84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中,构建表达载体pGLE -416和pGLE -152; 然后将pGLE -152和pGLE -416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件.结果与pGLE相比,pGLE -152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0.05),且在不同的细胞中增强的幅度明显不同.结论 NGAL基因的启动子位于-152～ 84区段内,启动子的强弱具有细胞特异性,这可能与增强子的协同作用相关联.     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

食管癌细胞NGAL 基因-416～+84 区段存在TPA 反应元件

 目的 本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法 （1）采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5’侧翼区-416-＋84片段，然后分别插入质粒pGLB和pGLE，构建pGLB-416和pGLE-416荧光素酶报告基因表达栽体；（2）将pGLB-416和pGLE-416分别同pRL—TK共转染食管癌细胞EC109；（3）用TPA刺激转染的EC109，检测细胞相对荧光素酶活力，通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5’侧翼-416～＋84区是否存在TPA反应元件，同时进行生物信息学分析。结果 无论是pGLB-416还是pGLE-416，与pRL-TK共转染食管癌细胞EC109后，用TPA刺激，与其相应的空载体相比，转染细胞荧光素酶活力均极显著升高（t检验，P〈0．01），约分别升高46．82和46．41倍；而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比，pGLB-416和pGLE-416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5．17倍和7．37倍（t检验，P〈0．01）。生物信息学分析显示，NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论 食管癌细胞NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段存在着TPA反应元件。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的：对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白(neutrophil gelatlnase-associated lipocalin。NGAL)基因5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法：以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因5′侧翼区(-1431～ 84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果：在NGAL基因5′端-945～-658和-657～-4172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用，而在-416～-152区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论：在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着2个转录增强子元件和1个转录沉默子元件。     

NGAL基因5''''侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定

背景与目的:构建NGAL基因5'侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体.材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5'侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431～ 84).PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic.重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定.结果:成功构建NGAL基因5'侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-GO～G6.结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5'侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件.     

E2F1对XRCC1启动子调节作用的研究

目的：探讨E2F1对XRCC1启动子的调节作用及其意义。方法：PCR扩增XRCC1启动子序列克隆至pGL3-Basic荧光报告载体上，与E2F1或突变的E2F1（132E）表达载体分别同时转染SaO2细胞；从基因Bank中调取XRCC1启动子序列和E2F结合位点序列分析其相关性；设计引物逐渐从5′端删除与E2F结合位点相关的序列，将PCR产物分别克隆至pGL3-Basic荧光报告载体上，转染至SaO2细胞。细胞裂解后与β-gal反应液一同保温，570nm处读取吸光度值。结果：XRCC1与E2F1共转染后，可以诱导XRCC1荧光强度的增加；XRCC1启动子序列5′端-819～-803与E2F结合住点相关，删除5′端序列使荧光强度减少。结论：E2F1作用于XRCC1启动子序列，上调XRCC1转录。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和 1个转录沉默子元件     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

LCRG1基因5''端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚, 本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列, 寻找与其表达有关的调控序列.方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中.与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,测序正确; pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3 basic 的35倍.结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191 bp～ 585 bp),该片段具有启动子活性.     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论 :多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素     

食管癌细胞 SHEEC中NGAL基因 5′-UTR和 3′-UTR的克隆与鉴定

背景与目的 : NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因是 lipocalin家族的一个新成员 . 以往我们曾研究发现 NGAL基因在 TPA诱导永生化食管上皮细胞 SHEE向食管癌细胞 SHEEC恶性转化的过程中显著过表达 , 但表达调控机制不清楚 . 本研究拟从 SHEEC细胞中克隆 NGAL基因的 5′ -UTR和 3′ -UTR( untranslated region) 并进一步明确其结构特征 . 方法 : 采用 RACE方法从 SHEEC细胞中克隆 NGAL基因的 5′ -UTR和 3′ -UTR; 在测序基础上进行 BLAST分析鉴定 . 结果 : 结合以往的实验结果 , 从 SHEEC细胞中克隆了 NGAL基因的 69 bp 5′ -UTR和 147 bp 3′ -UTR, 而且序列分析未发现突变 . 结论 : SHEEC细胞中的 NGAL基因具备完整的 5′ -UTR和 3′ -UTR结构 .     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的：从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5’端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法：采用PCR法克隆NGAL基因5’端转录调控区，并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果：从SHEEC中获得了NGAL基因5’端转录调控区-1124— 65区段的克隆，该区段序列有3处点突变，在NGAL基因-1124— 65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点。结论：多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素。     

Puma荧光素酶报告基因的构建和鉴定

目的为研究p53家族调控细胞凋亡的机制,构建并鉴定插入人Puma基因的启动子片段的荧光素酶报告基因载体。方法采用PCR技术从人类HepG2细胞中扩增Puma启动子的含p53反应元件的180bpDNA片段,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。经测序确定所扩增的DNA序列;将其转染人人类肺腺癌141299细胞中,双报告基因实验检测荧光素酶活力。结果测序结果表明扩增的Puma启动子序列正确,活性检测显示构建的报告基因具有启动子活性。结论克隆了含p53反应元件的Puma启动子,成功构建了人类Puma启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

mRNA差异显示法筛选和克隆胃癌相关基因

目的：筛选和克隆胃印戒细胞癌与正常胃黏膜细胞差异表达基因片段。方法：采用mRNA差异显示法(mRNA differential dlsplay PCR，DD-PCR)，对比胃印戒细胞癌组织与正常胃黏膜组织mRNA的表达差异，克隆胃印戒细胞癌差异片段，经过RNA的斑点杂交、测序以及序列分析和同源性比较。结果：胃印戒细胞癌与正常胃黏膜中存在明显的基因表达差异，发现与胃癌相关的差异表达条带16条，其中7条为缺失表达条带，9条为过度表达条带。对其中4条差异表达条带进行克隆、测序，经序列分析及同源性比较和RNA的斑点杂交，表明确认其中1条为GenBank／BLAST中尚未收录的片段。结论：胃印戒细胞癌的mRNA差异显示证明，该EST序列可能在胃癌的发生发展中具有一定作用。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

叶绿酸抗细胞恶变相关cDNA序列的克隆

目的：克隆叶绿酸抑制人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化的相关差异表达cDNA序列。方法：以叶绿酸及反式－BPDE共同处理的16HBE2细胞为实验细胞，以反式－BPDE单独处理的16HBE细胞为对照细胞，采用cDNA代表性差异分析法，比较2种细胞基因表达的差异，分离叶绿酸抗反式－BPDE作用的相关差异表达cDNA片段。分离的片段分别与pGEM-T载体连接并转化入JM109细菌中，对质粒DNA进行测序。以BLASTN程序进行GenBank的同源性检索。结果：克隆的5条cDNA序列中，有3条为新基因序列，另2条分别与类S18／S6人核糖体蛋白及alpha-烯醇酶等有同源性。结论：克隆的5条cDNA序列所在的基因可能与叶绿酸抗细胞恶性转化分子机制密切相关。