鼻咽癌细胞系抗失巢凋亡特性的研究

目的：探讨鼻咽癌细胞系的抗失巢凋亡特性。方法：采用鼻咽癌细胞系CNE2、C666—1、TW03以及正常鼻咽上皮细胞系NP69作为正常对照,用软琼脂实验、悬浮培养等方法诱导失巢凋亡,并用AnnexinV—PI双染色流式细胞计观察凋亡情况。结果：鼻咽癌细胞株CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。3种鼻咽癌细胞均能在软琼脂上形成集落,并在培养24h后即可出现,1周内形成的集落速度较快。悬浮培养的鼻咽癌细胞同样出现细胞集落,而NP69细胞未见细胞集落出现。悬浮培养的鼻咽癌细胞在培养48h后凋亡率并没有升高。而NP69细胞则出现了凋亡。结论：鼻咽癌细胞系CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。     

度他雄胺和“扶正抑瘤”中药复方对人前列腺癌PC-3细胞转移抑制效应的对照研究

目的:通过失巢凋亡抑制,对照研究新型5α还原酶抑制剂—度他雄胺和由人参、姜黄、肿节风组成的"扶正抑瘤"中药复方调控人前列腺癌PC-3细胞转移的效应。方法:采用人前列腺癌PC-3细胞体外培养的方法;MTT法检测PC-3细胞对度他雄胺和中药复方含药血清的敏感度,并确定两者的浓度梯度;软琼脂集落形成实验法观察两者对PC-3细胞失巢条件下增殖的影响;以Poly-HEMA包被培养细胞悬浮生长和琼脂糖电泳实验观察两者对PC-3细胞失巢凋亡的诱导作用;并采用流式细胞仪PI单染和AV-PI双染定量检测各组细胞凋亡率。结果:MTT比色法确定度他雄胺的浓度梯度为15%(低剂量),30%(中剂量)和45%(高剂量),中药复方为30%(中剂量);软琼脂集落实验表明度他雄胺45%含药血清组和中药复方含药血清组对细胞集落形成数量具有抑制作用(P0.05),2组间比较无差异(P0.05);琼脂糖电泳显示度他雄胺45%含药血清组和中药复方含药血清组出现较明显凋亡DNA-Ladder条带;流式细胞检测PI单染显示,度他雄胺45%含药血清组和中药复方含药血清组可提高PC-3细胞失巢凋亡率(P0.01),AV-PI双染显示度他雄胺各浓度组和中药复方含药血清组仅具有提高细胞早期失巢凋亡率的趋势(P0.05)。结论:度他雄胺可抑制人前列腺癌PC-3细胞在失巢条件下增殖,并呈现一定的浓度依赖性,中药复方也可抑制人前列腺癌PC-3细胞在失巢条件下增殖,两者效应相当,两者均对PC-3细胞失巢凋亡具有相似诱导作用,但对细胞早期凋亡诱导作用均有限。     

SIAH1可通过上调Bim表达诱导乳腺癌细胞失巢凋亡

目的 研究SIAH1对乳腺癌细胞失巢凋亡的影响及其相关机制.方法 采用脂质体介导法将SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1、对照质粒pcDNA3-myc、Bim干扰片段BimsiRNA和对照片段control siRNA转染入乳腺癌细胞系MCF-7,利用Western blot法检测SIAH1和Bim的表达,并应用Annexin V-FITC/PI试剂盒及流式细胞仪技术分析各组细胞在悬浮和贴壁生长状态下细胞的凋亡情况.结果 与未处理组及转染对照质粒组相比,转染SIAH1表达质粒后,SIAH1(P＜0.05)和Bim(P＜0.05)表达均明显上调,且失巢凋亡率明显增加,分别为7.36％、8.02％及38.4％.另外,与单独转染SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1相比,共转染pcDNA3-myc-SIAH1与Bim siRNA后,Bim表达显著降低(P＜0.05),同时细胞失巢凋亡率明显降低(P＜0.05),分别为36.8％与8.16％.结论 过表达SIAH1可通过上调Bim表达来诱导乳腺癌细胞失巢凋亡.     

RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞失巢凋亡的影响

目的： 观察RNA干扰沉默MTA1基因对膀胱癌细胞株BIU-87增殖和失巢凋亡的影响。方法： 构建针对MTA1基因的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）,应用MTA1 siRNA转染处理人膀胱癌细胞株BIU-87后,分别采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测MTA1基因mRNA和蛋白的表达,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测BIU-87细胞失巢凋亡。结果： 与对照组比较,MTA1 siRNA转染组MTA1 mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性（P<0.01）。MTA1 siRNA转染组软琼脂集落形成数明显减少,且与浓度相关（P<0.01）。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术结果显示,MTA1 siRNA转染可诱导BIU-87细胞失巢凋亡,且与浓度相关（P<0.01）。结论： MTA1 siRNA可抑制膀胱癌细胞株BIU-87增殖,诱导失巢凋亡可能是其机制之一。     

促肝细胞再生磷酸酶-3基因对大肠癌细胞侵袭和失巢凋亡的调控

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver cell-3,PRL-3)基因对大肠癌细胞侵袭的影响及可能机制.方法 应用PRL-3基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人大肠癌HCT116细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PRL-3 mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测癌细胞失巢凋亡情况.结果 转染组癌细胞PRL-3 mRNA和蛋白水平明显被抑制,且与时间和浓度相关.与对照组比较,转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少,且呈时间和浓度依赖性.琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示,转染组细胞出现明显的凋亡现象:凋亡指数增加,出现明显的DNA条带.结论 PRL-3基因siRNA转染可明显抑制大肠癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关.     

人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞的生物学特性研究

目的 获得人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞,了解其生物学特性.方法 采用本室建立的人永生化成骨细胞(hFOB1.19)恶性转化细胞株(转化细胞),用抗黏附培养法,模拟脱离基质情况,获得抗失巢凋亡细胞.电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪观察悬浮培养后不同时相点细胞的形态学改变和凋亡率.MTT法、Transwell小室分别检测细胞增殖情况和细胞的迁移能力.结果 形态学观察可见到典型的凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞悬浮后24、48、72 h的凋亡(PI染色)情况,凋亡率逐渐升高.抗失巢凋亡细胞再次悬浮同时相凋亡率与转化株相比下降;抗失巢凋亡细胞较对照组(转化细胞)的细胞增殖能力增强,迁移能力增强,转化细胞差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经过14 d的悬浮培养处理后,获得的人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞小仅抗失巢凋亡能力有所增强,增殖能力和迁移能力也有增强.     

紫草素对肾透明细胞癌抗凋亡作用与机制研究

目的 探究紫草素对肾透明细胞癌凋亡及抗失巢凋亡的作用及其机制.方法 实验分为四组,对照组、紫草素低、中、高剂量组(1、2、4mg/mL),加入786-O人肾细胞腺癌细胞中,CCK8检测肾透明细胞癌细胞活力,细胞集落实验和poly-HEMA悬浮培养检测肾透明细胞癌失巢凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡能力;caspase-3试...     

3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡

【目的】 探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖?迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制?【方法】 以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞?Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡;免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬;CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室检测细胞迁移能力?【结果】永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3 ± 2.63)个集落,对照组形成(9 ± 3)个,与H6C7 相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力 (P < 0.05)?3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P < 0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P < 0.01)且诱导失巢凋亡(P < 0.01)?【结论】 3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关?     

姜黄素抑制结肠癌SW620细胞侵袭的体外实验研究

目的：观察姜黄素对结肠癌SW620细胞侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法：应用姜黄素处理人结肠癌细胞系SW620后,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭性,采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEI,检测癌细胞失巢凋亡。结果：姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和穿膜侵袭能力,且与浓度相关。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示,姜黄素可诱导结肠癌细胞失巢凋亡,且与浓度和时间相关。结论：姜黄素呵抑制人结肠癌细胞侵袭,诱导失巢凋亡是其机制之一。     

紫草素对肾透明细胞癌抗凋亡的作用与机制研究

目的 探究紫草素对肾透明细胞癌凋亡及抗失巢凋亡的作用,并进一步在机制上探究其对抗凋亡相关信FAK(局部粘着斑激酶)、AKT（蛋白激酶B）、Src（原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src）、GSK3b（糖原合成酶激酶3）活化和促凋亡信号caspase-3的影响。方法 CCK8检测紫草素对肾透明细胞癌细胞活力的影响,细胞集落实验和poly-HEMA悬浮培养检测紫草素对肾透明细胞癌失巢凋亡的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡能力;caspase-3试剂盒法检测紫草素对肾透明细胞癌caspace-3活性的影响,Western blot检测紫草素作用后细胞失巢凋亡相关信号FAK、AKT、Src、GSK3b的活化情况以及下游靶基因的表达情况。结果 CCK8检测细胞活力发现,紫草素对肾透明细胞癌细胞的活力具有明显的抑制作用,且随着紫草素剂量的增加,细胞活力呈现剂量依赖性的下降（P＜0.01）。将肾透明细胞癌786-O在软琼脂上培养10d形成集落,结果显示,与对照组相比,低、中、高剂量组的细胞集落数明显减少（P＜0.01）,且呈剂量依赖性下降。poly-HEMA条件培养也表明,紫草素能明显抑制细胞失巢悬浮后的聚团能力。流式细胞仪检测细胞凋亡率显示,对照组0.40±0.52%;低剂量组8.0%±0.98%;中剂量组19±1.22%;高剂量组35±1.35%。低、中、高剂量组与对照组相比差异均具有统计学意义（P ＜ 0. 05或P＜0.01）;caspase-3细胞活性检测显示,无论是贴壁生长还是非粘性生长的肾透明细胞癌经紫草素处理后caspase-3活性均明显下降（P ＜ 0. 01或P＜0.001）;Western blot结果显示,紫草素能明显降低肾透明细胞癌细胞786-O中 FAK、AKY、Src、GSK3b的磷酸化激活,与对照组相比均有显著性差异;RT-PCR结果显示,紫草素能明显诱导FasL、Bim等促凋亡分子mRNA的表达。结论 紫草素能明显促进肾透明细胞癌的凋亡并降低其抗失巢凋亡的能力,其机制上可能是由于紫草素抑制了抗凋亡信号的激活和促凋亡信号caspase-3的活化,进一步促进了促凋亡分子FasL、Bim的表达。     

不同浓度Netrin-1对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响研究

目的 探讨不同浓度Netrin-1对滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响。 方法 行经0、10、100及1 000 ng/ml Netrin-1干预TEV-1 24 h后,采用噻唑兰MTT比色法检测细胞增殖指数、流式细胞法检测细胞凋亡率,采用免疫荧光组织化学方法鉴定TEV-1表达Netrin-1情况,采用实时定量PCR及western印迹分别检测各组细胞Netrin-1mRNA及蛋白变化情况。 结果 以递增浓度的Netrin-1预处理TEV-1细胞24 h后,TEV-1细胞增殖行为无影响,但TEV-1细胞凋亡率随Netrin-1浓度增加而降低,当Netrin-1刺激浓度达1 000 ng/ml时,TEV-1细胞总凋亡率下降至(6.63±0.07)%,较空白组(0 ng/ml)凋亡率(14.44±0.85)%下降明显(P<0.01)。Netrin-1表达于滋养细胞细胞质。在培养的滋养细胞株TEV-1中加入不同剂量的Netrin-1干预24 h后,TEV-1 Netrin-1蛋白表达水平无明显变化。 结论 Netrin-1能明显降低滋养细胞的凋亡程度,期间涉及机制与滋养细胞Netrin-1表达水平无关。      

人生长激素释放激素受体剪接变异体1型对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的：探讨人生长激素释放激素受体剪接变异体1型（GHRHR SV1）对肝癌细胞系HepG2增殖的影响,阐明GHRHR SV1对人肿瘤细胞的促增殖作用。方法：将GHRHR SV1真核表达载体导入HepG2细胞建立HepG2-SV1细胞系。设计对照组（野生型HepG2）、空载质粒组（HepG2-pCDNA3.0细胞系）和干扰组（HepG2-SV1细胞系）。采用PCR和Westernblotting法鉴定HepG2-SV1细胞系,CCK-8法检测各组细胞的增殖率,克隆形成实验检测各组细胞的单克隆形成率,细胞划痕实验检测细胞的迁移率。结果：PCR与Westernblotting法检测,构建的HepG2-SV1细胞系能稳定表达GHRHR SV1;CCK-8法检测,干扰组HepG2-SV1细胞系的增殖率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系（P<0.05）;克隆形成实验,干扰组HepG2-SV1细胞系的单克隆形成率约为空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系的3.5倍（P<0.05）;细胞划痕实验,所构建的干扰组HepG2-SV1细胞系的迁移率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系（P<0.05）。结论：GHRHR SV1能促进HepG2细胞的增殖。     

稳定表达人细胞色素P450 1A2的HepG2细胞的建立及其代谢效应

目的：建立稳定表达人细胞的色素P450 1A2(CYP1A2)的HepG2细胞。方法：将所克隆的野生型CYP1A2 cDNA从重组质粒pGEM-CYP1A2中用Kpn Ⅰ／BamHⅠ双酶切，并亚克隆到哺乳动物细胞表达栽体pREP9中。再将重组质粒转化感受态大肠杆菌Top10，用氨苄青霉素抗性筛选和限制酶谱鉴定。改良的磷酸钙介导的细胞转染法将重组质粒pREP9-CYP1A2转染肝癌细胞HepG2，用RT-PCR技术对转基因细胞的CYP1A2mRNA表达作了分析，并用MTT法比较转基因细胞对黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒敏感试验。结果：与HepG2细胞相比，HepG2-CYP1A2转基因细胞表达CYP1A2 mRNA，能增强AFB1的细胞毒作用。结论：建立了稳定表达CYP1A2的转基因细胞系，可用于由CYP1A2参与的毒理学与药物代谢研究。     

ZD6474对肝癌细胞和乙肝相关肝癌细胞增殖的影响

目的:探讨ZD6474对肝癌细胞株HepG2和乙肝相关肝癌细胞株HepG2.2.15细胞增殖的影响.方法:用WST方法检测ZD6474对细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检测ZD6474对细胞周期及凋亡的影响.结果:ZD6474可以显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,6.4 μmol/L的ZD6474可以抑制(46.86±10.32)％的HepG2和(41.24±7.35)％的HepG2.2.15细胞增殖,其抑制增殖作用随剂量增加而增强(P＜0.05).ZD6474诱导细胞产生G0/G1期阻滞,6μmol/L的ZD6474可诱导71.90％的HepG2和69.90％的HepG2.2.15细胞阻滞于G0/G1期.结论:ZD6474可以抑制HepG2和HepG2.2.15细胞增殖,其机制可能与诱导细胞周期阻滞有关.     

E2F-1基因对HepG2肝癌细胞增殖影响的研究

目的了解转录因子E2F-1对肝癌细胞HepG2增殖的影响。方法脂质体Lipofectami-neTM2000将pCMV-E2F-1-HA2载体转染HepG2肝癌细胞,然后用含G418的培养液筛选获得具有Genectin抗性的过表达E2F-1的肝癌细胞株。通过MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖的变化。结果 MTT和克隆形成实验结果显示,过表达E2F-1的HepG2/E2F-1细胞组与HepG2/EV细胞组和HepG2细胞组相比,其增殖速度明显减慢(P<0.01)。结论 E2F-1基因过表达可抑制HepG2肝癌细胞的增殖。     

MAGI1通过调节PETN抑制肝癌细胞的侵袭运动

目的:探讨MAGI1基因在肝癌侵袭转移中的作用及分子机制.方法:将MAGI1过表达载体,稳定转染HepG2细胞(HepG2MAGI1),应用划痕愈合实验和基质胶侵袭实验检测HepG2MAGI1 和对照组细胞(HepG2)在细胞运动侵袭能力上的差别.采用Western印迹方法检测MAGI1和PTEN的表达,并分析其相关性...     

Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1

Background  The multidrug resistance (MDR) associated with the expression of the mdr1 gene and its product P-glycoprotein is a major factor in the prognosis of hepatocellular carcinoma cell (HCC) patients treated with chemotherapy.  Our study was to establish a stable HCC MDR cell line where a de novo acquisition of multidrug resistance specifically related to overexpression of a transgenic mdr1.
Methods  The 4.5-kb mdr1 cDNA obtained from the plasmid pHaMDR1-1 was cloned into the PCI-neo mammalian expression vector, later was transferred by liposome to human hepatocarcinoma cell line HepG2. Then the transfected HepG2 cells resisting G418 were clustered and cultured and the specific fragment of mdr1 cDNA, mRNA and the P-glycoprotein (Pgp) in these HepG2 cells were detected by PCR, RT-PCR and flow cytometry, respectively.  The accumulation of the daunorubicin was determinated by flow cytometry simultaneously. The nude mice model of grafting tumour was established by injecting subcutaneously HepG2/mdr1 cells in the right axilla. When the tumour diameter reached 5 mm, adriamycin was injected into peritoneal cavity. The size and growth inhibition of tumour were evaluated.
Results  The mdr1 expression vector was constructed successfully and the MDR HCC line HepG2/mdr1 developed.  The PCR analysis showed that the specific fragment of mdr1 cDNA in HepG2/mdr1 cells, but not in the control group HepG2 cells. Furthermore, the content of the specific fragment of mdr1 mRNA and Pgp expression in HepG2/mdr1 cells were (59.7±7.9)% and (12.28±2.09)%, respectively, compared with (16.9±3.2)% and (3.07±1.06)% in HepG2 cells.  In the nude mice HCC model, the tumour genes of both groups were identified. After ADM therapy, the mean size of HepG2 cell tumours was significantly smaller than HepG2/mdr1 cell tumours.
Conclusion  The approach using the transfer of mdr1 cDNA may be applicable to the development of MDR hepatocarcinoma cell line, whose MDR mechanism is known. This would provide the experimental basis of MDR research.

     

Effects of the Extract of Ammopiptanthus mongolicus cheng f. （JA1） on Induction of Apoptosis of HepG2 in vitro and Its Molecular Mechanisms

Objective To study the effects and the mechanisms of extract from a leguminous plant （Ammopiptanthus mongolicus cheng f.） （JAl ） in northwest China on inducing apoptosis and inhibiting proliferation of HepG2 hepatocarcinoma cell in vitro. Methods The HepG2 cell line was used as target cells. The effect of 3A 1 on HepG2 cell growth was detected by microculture tetrazolium assay （MTr）, flow cytometry assay, DNA agarose gel electrophoresis and transmission electronic microscopy. The expressive effect of the wt-p53 in HepG2 cells was analyzed with p53 protein test-reagent. Results JAl not only had significant anti-proliferative effects depending upon time and dosage, but also induced apoptosis of HepG2 cells. Apoptotic typical morphological changes were observed in JAl-treated HepG2 cells under transmission electronic microscope, ＂Sub-G 1＂ phase peak occurred in flow cytometry and DNA ＂ladder＂ was found in DNA agarose gel electrophoresis. The expression of the wt-p53 increased in vitro, and 3Al-treated HepG2 and the positive cell percentage of the wt-p53 protein also increased. Conclusions JAl could obviously induce apoptosis and inhibit proliferation of HepG2 cells in vitro, and these effects are closely related with the increase of wt-p53 expression. JAl can be used as a good source of medicinal plant for the treatment of hepatocarcinoma.     

Reversal of HCC Drug Resistance by Using Hammerhead Ribozymes against Multidrug Resistance 1 Gene

To reverse multidrug resistance（MDR） of HepG2 by anti-MDR1 hammerhead ribozyme, an anti-MDR1 hammerhead ribozyme was developed and delivered to P-gp-overproducing human hepatocarcinoma cell line HepG2 by a retroviral vector containing RNA polymerase Ⅲ promoter. The expression of mdrl/Pgp and Rz was detected in HepG2, HepG2 muhidrug-resistant cell line and HepG2 Rz-transfected cells by semi-quantitative RT-PCR and Western blot methods. Moreover, MTT assay was employed to detect the sensitivity of these ribozyme-transfected cells, and Rhodamine123 （Rh123） was used to test the function of Pgp. The Rz- transfected HepG2 cells became doxorubicin-sensitive, which was concomitant with the decreased MDR1 expression. The study showed that the retrovirus vector encoding the anti-MDR1 ribozyme may be applicable to the treatment of MDR cells.     

痰热清注射液抑制HepG2细胞的研究

目的研究痰热清注射液对HepG2肝癌细胞株的抑制及对细胞周期的影响。方法采用MTT法检测痰热清注射液对HepG2肝癌细胞株的抑制,采用凯基细胞周期法检测该药对细胞周期的影响。结果痰热清注射液呈剂量依赖性抑制HepG2细胞,使细胞阻滞于G0/G1期,细胞DNA合成减少。结论痰热清注射液对肝癌细胞具有一定抑制作用,可能与使细胞阻滞于休眠期或DNA合成前期,导致细胞DNA合成减少有关。